彥飛，陳兆安，曹旭鵬，陸洪斌，薛松，張衛(wèi)

1 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 海洋生物產(chǎn)品工程組，大連 116023 2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100039

亞心形四爿藻氫酶的穩(wěn)定性及初步純化

彥飛1,2，陳兆安1，曹旭鵬1，陸洪斌1，薛松1，張衛(wèi)1

1 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 海洋生物產(chǎn)品工程組，大連 116023 2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100039

亞心形四爿藻Tetraselmis subcordiformis是一種具有高產(chǎn)氫能力的海洋綠藻，在厭氧環(huán)境中經(jīng)暗誘導(dǎo)調(diào)控，可進(jìn)行一定時(shí)間的連續(xù)產(chǎn)氫。氫酶是亞心形四爿藻進(jìn)行光合產(chǎn)氫的關(guān)鍵酶，本文研究了在厭氧環(huán)境中連二亞硫酸鈉、β-巰基乙醇和丙三醇等試劑對氫酶的穩(wěn)定性影響，考察了硫酸銨分級沉淀對氫酶的純化效果及回收情況。結(jié)果表明，連二亞硫酸鈉和丙三醇均能對氫酶起到較好的保護(hù)作用。60%～70%飽和度硫酸銨沉淀出的蛋白樣品比酶活較高，且所含其他蛋白較少，可用于氫酶的進(jìn)一步純化。

亞心形四爿藻，氫酶穩(wěn)定性，硫酸銨分級沉淀

Abstract:Tetraselmis subcordiformis, a marine green alga, can produce hydrogen by photobiologically hydrolyzing seawater with hydrogenase.In this study, the preliminary purification of the enzyme was explored by ammonium sulfate precipitation, and the impact of sodium dithionite, β-mercaptoethanol and glycerol on the enzyme stability during the process was investigated.The experimental results illustrated that sodium dithionite provided significant protection on the hydrogenase by depleting oxygen, while glycerol, a protectant against the structure instability of the enzyme, also presented protection.Crude enzyme with specific activity of 0.557 U/mg protein was extracted using 60%?70% saturated ammonium sulfate solution supplemented with 200 mmol/L sodium dithionite and 5% glycerol, and the hydrogenase recovery yield was about 30%.

Keywords:Tetraselmis subcordiformis, hydrogenase stability, ammonium sulfate precipitation

氫是一種理想的二次能源載體[1-2]。國際氫能組織預(yù)測，隨著制氫、儲氫和氫能使用技術(shù)的發(fā)展，到 2050年左右氫能將在全球能源構(gòu)成中占據(jù)至關(guān)重要的地位。生物制氫技術(shù)由于具有低成本、可再生、清潔無污染等優(yōu)點(diǎn)，受到了人們的關(guān)注[3-6]。

綠藻制氫是生物制氫領(lǐng)域中的一個(gè)重要方向[7-11]。綠藻利用可逆氫化酶產(chǎn)氫，催化效率高，不需要大量的 ATP，生產(chǎn)過程潔凈，可以實(shí)現(xiàn)光能的自組織收集，能量的自發(fā)積累及定向快速轉(zhuǎn)化，被國際能源局認(rèn)為是生物制氫最有應(yīng)用前景的途徑之一。綠藻在光合作用Ⅱ過程中能將水分解成氧氣、質(zhì)子和電子，電子經(jīng)過光合系統(tǒng)Ⅰ的電子傳遞鏈及鐵氧化還原蛋白傳遞給氫酶，氫酶將質(zhì)子還原為氫氣。氫酶在這個(gè)過程中起著關(guān)鍵作用，但氫酶對氧氣非常敏感，在有微量氧氣存在時(shí)就會失活[12]。目前國內(nèi)有多家科研單位對綠藻制氫進(jìn)行研究，但與綠藻氫酶分離純化相關(guān)的工作極少見到報(bào)道。

亞心形四爿藻是一種海洋單細(xì)胞產(chǎn)氫綠藻，其產(chǎn)氫能力與國際上目前研究最深入的淡水萊茵衣藻的水平相當(dāng)[13-14]。為了提取亞心形四爿藻體內(nèi)的可溶性氫酶，進(jìn)行氫酶催化機(jī)理及失穩(wěn)失活機(jī)制等方面的基礎(chǔ)研究，本文報(bào)道了厭氧條件下幾種試劑對氫酶的穩(wěn)定性影響，并考察了硫酸銨分級沉淀對氫酶的純化效果。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種：亞心形四爿藻由遼寧省水產(chǎn)研究所提供，在本實(shí)驗(yàn)室純化培養(yǎng)。

儀器：GC-960T氣相色譜(上海海欣色譜儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 藻種的培養(yǎng)

采用滅菌天然海水(取自大連周邊海域)加入康維方營養(yǎng)鹽配制的培養(yǎng)基，每升海水培養(yǎng)基中各種鹽含量為：NaNO3100 mg，NaHCO3168 mg，NaH2PO4·H2O 20 mg，EDTA-Na 45 mg，H3BO333.6 mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 1.3 mg，MnC12·4H2O 0.36 mg，ZnC120.021 mg，CoCl2·6H2O 0.02 mg，CuSO4·5H2O 0.02 mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.009 mg。亞心形四爿藻置于25℃，日光燈光源，表面光照度為4 500 lx，光暗比為14 h∶10 h的條件下培養(yǎng)到對數(shù)生長后期。

1.2.2 氫酶的誘導(dǎo)

取3 L生長對數(shù)后期、濃度約2×106cells/mL的亞心形四爿藻，1 500 r/min離心2 min。倒掉海水后，取鮮重為10 g藻細(xì)胞，重新懸浮于100 mL滅菌海水中，置于密閉玻璃瓶中。通氮?dú)?0 min，排除容器中氧氣后，在黑暗中誘導(dǎo)4 h。

1.2.3 厭氧環(huán)境的構(gòu)建

氫酶對氧氣非常敏感，1%左右的氧氣即使其失活。因此自暗誘導(dǎo)開始，所有實(shí)驗(yàn)步驟均需在厭氧的環(huán)境中進(jìn)行(圖1)。將密封的樣品放入?yún)捬醮?，反?fù)充N2、抽真空3次后，開始純化操作。需要離心的樣品放在配有密封蓋的離心管中，拿出厭氧體系離心。如無特殊說明，所使用的試劑中均加入一定濃度連二亞硫酸鈉，以除去溶氧。

圖1 氫酶純化厭氧系統(tǒng)Fig.1 Anaerobic system used for hydrogenase isolation and purification.1: N2bottle; 2: vacuum pump; 3: manual valve; 4:vacuum bag; 5: vortex mixer.

1.2.4 細(xì)胞破碎

在厭氧環(huán)境中，將藻液分裝于密封離心管中，4 000 r/min離心3 min，棄上清后重懸于 10 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.9)中。在重懸液中加入10 g預(yù)冷玻璃珠(直徑約1 mm)，用渦旋振蕩器最大強(qiáng)度混旋5次，每次1 min，兩次之間在冰上靜置1 min。13 000 r/min離心10 min，取上清棄沉淀。

1.2.5 氫酶活性檢測

氫酶活性的測定在 6 mL密閉容器中進(jìn)行。以50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)作反應(yīng)緩沖液，用被連二亞硫酸鈉還原的甲基紫精作電子供體。反應(yīng)系統(tǒng)包括終濃度為5 mmol/L甲基紫精和100 mmol/L Na2S2O4，通高純N2排除氧氣5 min后，用注射器加入0.1 mL樣品。在25℃水浴中振蕩孵育20 min后，用氣相色譜檢測氫氣組分含量。

1.2.6 蛋白含量測定

使用Bradford法測定總蛋白含量。取100 μL樣品，加入2 mL顯色液(95%乙醇25 mL，85%磷酸50 mL，35 mg考馬斯亮藍(lán)G250，加水至500 mL)，室溫下反應(yīng)5 min后，測定在595 nm處的光吸收值。以2 mL顯色液加入 100 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.9)的處理作為空白對照，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。本步驟在空氣環(huán)境中進(jìn)行。

1.2.7 硫酸銨分級沉淀

在厭氧袋中，向上清中加入固體(NH4)2SO4，依次至 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%飽和度，同時(shí)磁力攪拌均勻。每次沉淀在4℃、13 000 r/min離心10 min，將沉降出的蛋白溶于1 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.9)中，上清繼續(xù)進(jìn)行硫酸銨沉淀。

1.2.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳方法參見文獻(xiàn)[15]。分離膠濃度為15%，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。本步驟在空氣環(huán)境中進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 氫酶的穩(wěn)定性研究

為了能夠在氫酶純化過程中進(jìn)行活性跟蹤，保證氫酶穩(wěn)定性是非常重要的。針對其特性，考察了幾種試劑對氫酶的保護(hù)效果。

2.1.1 連二亞硫酸鈉對氫酶的影響

即使放在厭氧袋中，試劑中仍有溶氧存在，這將嚴(yán)重影響氫酶的穩(wěn)定性。為了消除溶氧，應(yīng)在所有試劑中加入強(qiáng)還原劑連二亞硫酸鈉?？疾炝瞬煌瑵舛冗B二亞硫酸鈉對藻細(xì)胞破碎液上清液中氫酶活性的影響，結(jié)果如圖2所示。若不加連二亞硫酸鈉，上清液的氫酶活性僅為0.0024 U/mg 蛋白。將連二亞硫酸鈉濃度增加到10 mmol/L 和20 mmol/L時(shí)，氫酶活性均有大幅度提高，分別達(dá)到0.091 U/mg 蛋白和0.169 U/mg 蛋白。此后再增加連二亞硫酸鈉則沒有明顯效果。

圖2 不同濃度連二亞硫酸鈉對溶液中氫酶活性的影響Fig.2 Effects of sodium dithionite on hydrogenase activity in solution.

氫酶的硫酸銨沉淀過程中，在緩沖液中含有20 mmol/L連二亞硫酸鈉的條件下，氫酶活性損失現(xiàn)象仍然十分嚴(yán)重。這可能是因?yàn)樵谙到y(tǒng)中加入大量硫酸銨的同時(shí)也帶入了氧氣。因此，需要增加緩沖液中的連二亞硫酸鈉濃度。圖3顯示了以80%飽和度硫酸銨沉淀時(shí)，連二亞硫酸鈉濃度對氫酶活性的影響?？梢钥闯?，連二亞硫酸鈉濃度需達(dá)到200 mmol/L，方可有效保護(hù)氫酶活性，再增加則沒有明顯效果。

圖3 不同濃度連二亞硫酸鈉對硫酸銨沉淀時(shí)氫酶活性的影響Fig. 3 Effects of sodium dithionite on hydrogenase activity during ammonium sulfate fractionation.

2.1.2 β-巰基乙醇對氫酶的影響

β-巰基乙醇是提取蛋白時(shí)常用的保護(hù)劑，也是一種還原劑，其作用是保護(hù)蛋白質(zhì)上自由的巰基不被氧化，從而避免蛋白的聚集或變性。分別考察了細(xì)胞破碎后上清液中不含連二亞硫酸鈉和含20 mmol/L連二亞硫酸鈉時(shí)，不同濃度β-巰基乙醇對氫酶活性的影響。如圖4所示，在上清液中不含連二亞硫酸鈉時(shí)，隨β-巰基乙醇濃度的增大，氫酶活性也隨之增大，但加入20 mmol/L β-巰基乙醇尚不能完全消除體系中的溶氧，上清液的氫酶活性僅達(dá)0.005 U/mg蛋白。這說明β-巰基乙醇的還原性遠(yuǎn)低于連二亞硫酸鈉，不適宜用于建立厭氧環(huán)境。當(dāng)上清液含20 mmol/L連二亞硫酸鈉時(shí)，溶氧被消除干凈，氫酶活性達(dá)到0.17 U/mg蛋白左右(圖5)，這時(shí)加入各濃度β-巰基乙醇對氫酶活性均沒有影響。

圖4 溶液不含連二亞硫酸鈉時(shí)不同濃度 β-巰基乙醇對氫酶活性的影響Fig.4 Effects of β-mercaptoethanol on hydrogenase activity with no sodium dithionite in solution.

圖5 溶液中含20 mmol/L連二亞硫酸鈉時(shí)不同濃度 β-巰基乙醇對氫酶活性的影響Fig.5 Effects of β-mercaptoethanol on hydrogenase activity with 20 mmol/L sodium dithionite in solution.

2.1.3 丙三醇對氫酶的影響

由于實(shí)驗(yàn)條件限制，很難將整個(gè)厭氧純化系統(tǒng)放置于4℃環(huán)境中，因此氫酶的硫酸銨分級沉淀步驟是在室溫下進(jìn)行的。為保證氫酶的穩(wěn)定性，考慮在緩沖溶液中加入一定濃度的丙三醇。丙三醇能提供極性環(huán)境，維持蛋白質(zhì)離子鍵的穩(wěn)定；且丙三醇的羥基能與蛋白質(zhì)的極性氨基酸殘基形成氫鍵，從而使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)得到加固，增強(qiáng)蛋白質(zhì)功能的穩(wěn)定性。破碎細(xì)胞后，在上清液中加入10%丙三醇，靜置12 h，每隔2 h檢測氫酶活性。如圖6所示，與對照組相比，加入丙三醇的樣品氫酶活性隨時(shí)間的延長下降較為緩慢，室溫放置12 h后氫酶活性為原來的71%，而未添加丙三醇的對照組12 h后活性僅剩下55%。

圖6 10%丙三醇對氫酶的保護(hù)作用Fig.6 Protection effect of 10% glycerin to hydrogenase.1:buffer is 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.9)containing 20 mmol/L Na2S2O4and 10%(V/V)glycerin; 2: control group, buffer is 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.9)containing 20 mmol/L Na2S2O4.

此后考察了硫酸銨沉淀過程中不同濃度丙三醇對氫酶的影響。在蛋白溶液中分別加入3%、5%、10%、15%丙三醇(V/V)，并以 80%飽和度硫酸銨沉淀，13 000 r/min離心10 min。將獲得的蛋白溶于1 mL相應(yīng)緩沖液中，檢測其氫酶活性及蛋白含量。結(jié)果如表1所示，緩沖液加入丙三醇的樣品沉淀出的蛋白比酶活均高于對照組，加入 5%、10%濃度丙三醇的效果尤其明顯。加入15%丙三醇的樣品離心后沒有蛋白沉淀出來，這是因?yàn)榧尤敫邼舛缺紝?dǎo)致溶液密度增大，影響蛋白析出。加入10%丙三醇的樣品離心后沉淀出的蛋白在離心過后有小部分懸浮起來，也是溶液密度增大所致。因此，在硫酸銨沉淀過程中加入5%丙三醇可以起到最佳效果。

表1 不同濃度丙三醇對氫酶的保護(hù)作用Table 1 Protection effect of different concentration glycerin

2.2 硫酸銨分級沉淀對氫酶的純化

在采用優(yōu)化的氫酶穩(wěn)定性條件基礎(chǔ)上進(jìn)行了硫酸銨分級沉淀，所用粗酶液的總酶活為17.28 U，總蛋白含量為97.65 mg，比酶活為0.176 U/mg蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各飽和度沉淀出的蛋白樣品均具有一定的氫酶活性。其中 50%～60%、60%～70%、70%～80%飽和度沉淀出的蛋白，氫酶活性遠(yuǎn)高于其余組分，三者回收的氫酶占上清中氫酶總量的68%。其中 60%～70%飽和度沉淀獲得的樣品具有最高活性，占總量的30%(圖7)。對氫酶活性最高的幾個(gè)組分進(jìn)行分析，檢測蛋白含量，計(jì)算蛋白比酶活，結(jié)果如表 2所示。60%～70%飽和度沉淀樣品比酶活最高，為0.557 U/mg蛋白；與上清液相比，氫酶被純化了3.16倍，適合用于進(jìn)一步純化。

表2 硫酸銨沉淀對氫酶的純化Table 2 Purification of hydrogenase with ammonium sulfate precipitation

圖7 不同飽和度硫酸銨沉淀回收氫酶量Fig.7 Hydrogenase recovery of different ammonium sulfate saturation.

3 結(jié)論

本文首先考察了不同試劑對氫酶的穩(wěn)定性影響。結(jié)果表明，20 mmol/L和200 mmol/L連二亞硫酸鈉能消除系統(tǒng)中的溶氧，分別對溶液中氫酶和硫酸銨沉淀過程中氫酶具有較好的保護(hù)作用；各濃度β-巰基乙醇對氫酶活性均沒有明顯影響；5%(V/V)丙三醇能在硫酸銨沉淀過程中增加氫酶的穩(wěn)定性。然后用硫酸銨分級沉淀法，在厭氧環(huán)境中對亞心形四爿藻氫酶進(jìn)行了初步純化。60%～70%飽和度硫酸銨沉淀出的蛋白具有較高比酶活，且所含其他蛋白較少，可用于氫酶的進(jìn)一步純化。

REFERENCES

[1]Wunschiers R, Lindblad P.Hydrogen in education-a biological approach.Int J Hydrogen Energy, 2002,27(11/12): 1131?1140.

[2]Kruse O, Rupprecht J, Mussgnug JH,et al.Photosynthesis:a blueprint for solar energy capture and biohydrogen production technologies.Photoch Photobiol Sci, 2005, 4:957?970.

[3]Weaver PF, Lien S, Seibert M.Photobiological production of hydrogen.Sol Energy, 1980, 24(1): 3?45.

[4]Mitsui A, Philips EJ, Kumazawa S,et al.Progress in research toward outdoor biological hydrogen production using solar energy, sea water, and marine photosynthetic microorganisms.Ann New York Acad Sci, 1983, 413:514?530.

[5]Miyake J.Biological solar energy conversion-hydrogen generation.J Fibre, 1992, 48(1): 33?37.

[6]Zajic JE, Margaritis A, Brossenu JD.Microbial hydrogen production from replenishable resources.Int J Hydrogen Ener, 1979, 4(5): 385?402.

[7]Melis A, Zhang LP, Forestier M,et al.Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green algaChlamydomanas reinhardtii.Plant Physiol, 2000, 122(1):127?136.

[8]Florin L, Tsokoglou A, Happe T.A novel type of iron hydrogenase in the green algaScenedesmus obliquusislinked to the photosynthetic electron transport chain.J Biol Chem, 2001, 276(9): 6125?6132.

[9]Winkler M, Heil B, Happe T.Isolation and molecular characterization of the [Fe]-hydrogenase from the unicellular green algaChlorella fusca.Biochim Biophys Acta, 2002, 1576(3): 330?334.

[10]Uenoa Y, Kuranoa N, Miyachib S.Purification and characterization of hydrogenase from the marine green alga,Chlorococcumlittorale.FEBSLett, 1999,443(2):144?148.

[11]Guan YF, Deng MC, Yu XJ,et al.Two-stage photo-biological production of hydrogen by marine green algaPlatymonas subcordiformis.Biochem Eng J, 2004,19(1): 69?73.

[12]Happe T, Hemschemeier A, Winkler M,et al.Hydrogenase in green algae: do they save the algae’s life and solve our energy problem?Trends Plant Sci, 2002,7(6): 246?250.

[13]Guan YF, Zhang W, Deng MC,et al.Significant enhancement of photobiological H2evolution by carbonylcyanidem-chlorophenylhydrazone in the marine green algaPlatymonas subcordiformis.Biotechnol Lett,2004, 26(13): 1031?1035.

[14]Ran CQ, Yu XJ, Mei FJ,et al.Role of carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone in enhancing photobiological hydrogen production by marine green algaPlatymonas subcordiformis.Biotechnol Prog, 2006, 22(2): 1?6.

[15]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual.2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Stability of the hydrogenase from Tetraselmis subcordiformis and its preliminary purification

Fei Yan1,2, Zhao’an Chen1, Xupeng Cao1, Hongbin Lu1, Song Xue1, and Wei Zhang1
1 Marine Bioproducts Engineering Group, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China 2 Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China

Received:May 20, 2010;Accepted:June 23, 2010

Supported by:National Key Basic Research Program of China(973 Program)(No.2009CB220004), National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2006AA05Z106), National Natural Science Foundation of China(No.20806081), Knowledge Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences(Nos.KSCX2-YW-G-073, KSCX2-YW-373-2, KGCX2-YW-223, KSCX2-YW-G-002),Natural Science Foundation of Liaoning Province(No.20082152).

Corresponding author:Wei Zhang.Tel/Fax: +86-411-84379069; E-mail: weizhang@dicp.ac.cn國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃(973計(jì)劃)(No.2009CB220004)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2006AA05Z106)，國家自然科學(xué)基金(No.20806081)，中科院知識創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(Nos.KSCX2-YW-G-073, KSCX2-YW-373-2, KGCX2-YW-223, KSCX2-YW-G-002)，遼寧省自然科學(xué)基金(No.20082152)資助。