俞靜，江佳稀，張永強(qiáng)，呂紅，李育陽(yáng)，劉建平

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

鷹嘴豆孢克魯維酵母利用菊芋原料同步糖化與發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

俞靜，江佳稀，張永強(qiáng)，呂紅，李育陽(yáng)，劉建平

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

菊芋含有大量的菊粉多糖，且種植簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高，是極具開發(fā)價(jià)值的替代玉米等糧食作物生產(chǎn)燃料乙醇的原料。文中研究了鷹嘴豆孢克魯維酵母Y179利用菊芋原料同步糖化與發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。鷹嘴豆孢克魯維酵母Y179具有高效分泌菊粉酶的能力，搖瓶試驗(yàn)顯示Y179酵母能夠利用完全由菊芋原料配制而成的培養(yǎng)基良好生長(zhǎng)并發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。通氣及溫度對(duì)乙醇產(chǎn)量影響明顯，相對(duì)厭氧環(huán)境對(duì)Y179酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇具有促進(jìn)作用，30℃發(fā)酵溫度相對(duì)37℃和42℃更有利于乙醇產(chǎn)量提高。種子液培養(yǎng)時(shí)間及接種量對(duì)乙醇產(chǎn)量影響較小。在5 L發(fā)酵罐中以10%(V/V)量接入預(yù)培養(yǎng)36 h的Y179種子液，發(fā)酵液完全由菊芋干粉配制而成，總糖含量22%(W/V)，30℃不通氣，300 r/min攪拌，發(fā)酵144 h時(shí)，乙醇濃度達(dá)到12.3%(V/V)，糖醇轉(zhuǎn)化效率86.9%，糖利用率大于93.6%。初步研究結(jié)果顯示鷹嘴豆孢克魯維酵母Y179在利用菊芋原料生產(chǎn)乙醇方面具有良好應(yīng)用前景。

菊芋，鷹嘴豆孢克魯維酵母，菊粉酶，同步糖化與發(fā)酵，乙醇發(fā)酵

Abstract:Jerusalem artichoke tubers with inulin as major component are potential feedstock for fuel ethanol production, andKluyveromyces cicerisporusY179 expressing high level of inulinase is suitable for ethanol production with this feedstock by simultaneous saccharification and fermentation approach.In this article, the impact of inoculum, aeration and temperature on ethanol production by the yeast was studied.The experimental results illustrated that inoculum with different levels and seed collected at different cultivation times had negligible effect, while anaerobic conditions enhanced ethanol production, and more ethanol was produced by the yeast at 30°C than at 37°C or 42°C.The medium using Jerusalem artichoke tuber meal as sole component with 22%(W/V)total sugars was inoculated with 36 h-precultured seed at 10%(V/V), and the batch fermentation was conducted in a 5 L fermentor at 30°C with a stirring speed of 300 r/min under anaerobic conditions.After 144 h, 12.3%(V/V)ethanol was produced and the yield of ethanol from sugars was 86.9% of its theoretical one, with 93.6% sugars consumed.These results indicate thatK.

cicerisporusY179 is a promising candidate for industrial ethanol production using Jerusalem artichoke tuber feedstock.

Keywords:Jerusalem artichoke tubers,Kluyveromyces cicerisporus, inulinase, simultaneous saccharification and fermentation,ethanol fermentation

由于石油等化石類資源有限且呈枯竭之勢(shì)，能源短缺已是當(dāng)今社會(huì)面臨的一個(gè)重大問題。發(fā)展可再生生物質(zhì)能源是解決日趨緊張能源問題的有效途徑，其中燃料乙醇是發(fā)展生物質(zhì)能源的重要選擇。傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇主要以玉米、小麥等糧食作物為原料。鑒于我國(guó)人多地少、糧食生產(chǎn)壓力大，以糧食作物為原料的燃料乙醇發(fā)展空間受到極大限制，難以長(zhǎng)久支撐我國(guó)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展，菊芋、木薯等非糧作物因糖類含量豐富，成為可用于燃料乙醇生產(chǎn)的候選原料[1]。

菊芋塊莖富含菊粉(又稱菊糖，inulin)，達(dá)到濕重的15%～19%。菊粉是由多個(gè)果糖分子通過β-2,1-果糖苷鍵連接成的多聚果糖，其末端有 1個(gè)葡萄糖殘基以α-1,2鍵與之相連，呈直鏈結(jié)構(gòu)，其中75%～85%為果糖、15%～25%為葡萄糖，分子質(zhì)量3 500～5 500 Da。菊芋這種植物耐貧瘠、易種植、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高，在我國(guó)很多省份均有種植，極具開發(fā)價(jià)值。據(jù)我國(guó)小面積栽培情況，一畝菊芋可產(chǎn)塊莖1 250～5 000 kg，國(guó)外報(bào)道最高為6 000 kg[2]，可作為新的廉價(jià)糖源和燃料乙醇生產(chǎn)原料，但菊芋目前尚未得到很好的利用[3-4]。

菊芋是生產(chǎn)乙醇的良好糖源，其關(guān)鍵是菊粉(多聚果糖)在菊粉酶(Inulinase)作用下水解成為由果糖和少量葡萄糖組成的混合單糖，隨后果糖等單糖經(jīng)過酵母等微生物的發(fā)酵作用生成乙醇。利用菊芋生產(chǎn)乙醇自20世紀(jì)80年代起陸續(xù)有研究報(bào)道[5]。呂躍鋼等[6]以菊芋為原料，將釀酒酵母細(xì)胞與菊粉酶共同固定化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)溫度為30℃，pH值為5.5，發(fā)酵液糖度為20%(W/V)，反應(yīng)器連續(xù)流動(dòng)流速為13.15 mL/min時(shí)，發(fā)酵速度最快，酒精轉(zhuǎn)化率最高，發(fā)酵醪液中乙醇濃度達(dá)到11.98%(V/V)。Ge等[7]以菊芋為原料，利用黑曲霉和釀酒酵母混合菌發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。

鷹嘴豆孢克魯維酵母 Y179具有高效分泌菊粉酶的能力，本研究從種子液、通氣、溫度等多方面研究其利用菊芋原料同步糖化與發(fā)酵產(chǎn)乙醇基本過程，建立 Y179酵母生產(chǎn)菊芋原料乙醇基本工藝，為其進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

鷹嘴豆孢克魯維酵母 Y179，即Kluyveromyces cicerisporusCBS4857 (Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)，Yeast Division，Delft，The Netherlands)。

1.1.2 主要試劑及儀器

測(cè)定乙醇用酶類乙醇脫氫酶(ADH)、乙醇氧化酶(AOX)和過氧化物酶(Peroxidase)均購(gòu)自Sigma公司。測(cè)定還原糖用試劑3,5-二硝基水楊酸為國(guó)產(chǎn)分析純以上級(jí)產(chǎn)品。

WFJ7200型分光光度計(jì)(Unico公司)，5415D型臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf公司)，85-2型磁力攪拌器(上海司樂)，Labo Autoclave MLS-3780型濕熱滅菌設(shè)備(Sanyo公司)，KLF2000 5 L發(fā)酵罐(Bioengineering Laboratory Fermenter)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

菊芋提取液：將新鮮菊芋(由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)劉兆普教授饋贈(zèng))洗凈后，切片，然后用熱水(60 ℃ ～ 80 ℃)處理1 h左右，去除固型物后將提取液于115℃滅菌15 min，保存待用。

菊芋干粉：將新鮮菊芋洗凈后，切片烘干，用粉碎機(jī)磨粉，然后用40目篩子篩除大顆粒，得到的菊芋粉裝入試劑瓶密封保存。

菊芋發(fā)酵培養(yǎng)基由菊芋干粉加水或菊芋提取液溶解而成，115℃滅菌15 min后使用。

豐富培養(yǎng)基 YEPD：1%(W/V)酵母粉，2%(W/V)蛋白胨，2%(W/V)葡萄糖。121℃滅菌15 min后使用。

鷹嘴豆孢克魯維酵母一般在30℃培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速230～250 r/min。

1.2.2 分析方法

還原糖含量的測(cè)定使用 DNS(3,5-二硝基水楊酸)法[8]?？偺呛康臏y(cè)定：先用酸水解法水解菊粉等聚合糖，取適量樣品與等體積的 6 mol/L HCl在Eppendorf管中混合，37℃水浴反應(yīng)15 min。再與2倍樣品液體積的3 mol/L NaOH混合后，采取DNS法測(cè)定混合液中的糖含量。

菊粉酶活力測(cè)定及計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[9]。

乙醇測(cè)定采用乙醇氧化酶法或者氣相色譜方法。乙醇氧化酶法方法：新鮮配置0.067 mmol/L四甲基聯(lián)苯胺溶液(pH 7.0磷酸緩沖液)，再加入27 U乙醇氧化酶和500 U過氧化物酶混勻。取上述試劑3.5 mL，加入稀釋到乙醇濃度范圍 0.02%～0.1%(W/V)的樣品液0.1 mL，精確反應(yīng)15 min，加入0.5 mL 0.8 mol/L HCl終止反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液于450 nm處的吸光度[10]。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品液中的乙醇濃度。

2 結(jié)果

2.1 鷹嘴豆孢克魯維酵母Y179產(chǎn)菊粉酶分析

對(duì)Y179在實(shí)驗(yàn)室常用豐富培養(yǎng)基YEPD及菊芋提取液中生長(zhǎng)產(chǎn)菊粉酶的情況進(jìn)行了測(cè)定。研究顯示Y179能夠在YEPD培養(yǎng)基和菊芋提取液中良好生長(zhǎng)并高效分泌菊粉酶(圖1、2)。雖然Y179菌株在菊芋提取液中產(chǎn)菊粉酶能力略遜于在YEPD培養(yǎng)基中，但培養(yǎng)48 h、72 h時(shí)，菊粉酶活力仍分別達(dá)到120 U/mL、272 U/mL。Y179菌株在單一菊芋提取液培養(yǎng)基中能夠正常生長(zhǎng)并高效產(chǎn)酶的特點(diǎn)，為其利用菊芋原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇提供了便利。

圖1 Y179分泌表達(dá)菊粉酶SDS-PAGE檢測(cè)Fig.1 Expression of inulinase by Y179 was detected by SDS-PAGE.30 μL supernatant sample of Y179 cultured in YEPD medium after 0, 24, 48, 60, 72, 84 and 96 h incubation was subjected to electrophoresis at lanes 1, 2, 3, 4, 5, 6 and 7,respectively; M: protein marker.

圖2 Y179在YEPD和菊芋汁培養(yǎng)基中產(chǎn)菊粉酶曲線Fig.2 Time course of inulinase production by Y179 with YEPD and Jerusalem artichoke tuber juice medium.YEPD medium(●)and Jerusalem artichoke tuber juice medium containing 10%(W/V)total sugars(▲)were inoculated with 2%(V/V)inoculum of 17 h-precultured Y179 seed.The batch fermentation was conducted at 30°C with a stirring speed of 230 r/min under aerobic conditions.Inulinase activities in the fermentation broth were assayed.

2.2 好氧條件下 Y179利用菊芋培養(yǎng)基生長(zhǎng)基本性狀分析

鷹嘴豆孢克魯維酵母 Y179在通氣好氧條件下利用菊芋提取液作為唯一培養(yǎng)基成分生長(zhǎng)的基本性狀分析結(jié)果如圖3所示。Y179是一種生長(zhǎng)能力很強(qiáng)的酵母，在培養(yǎng)24 h后，其OD600大于40(圖3a)，其培養(yǎng)基pH值出現(xiàn)雙向變化，先從初始的5.2降至8 h的4.3，然后升高至24 h的6.5左右(圖3b)。培養(yǎng)24 h后，菊粉酶急劇增加，酶活達(dá)到80 U/mL左右(圖3c)。圖3d和圖3e顯示8 h時(shí)培養(yǎng)液中總糖含量從初始的11%(W/V)降至2%以下，還原糖濃度只有 0.5%(W/V)，說明絕大部分菊粉已被 Y179產(chǎn)生的菊粉酶降解成為單糖并消耗，而此時(shí)培養(yǎng)液中菊粉酶酶活僅10 U/mL左右，提示Y179菌株在菊芋培養(yǎng)基中生長(zhǎng)早期產(chǎn)生的少量菊粉酶足以水解原料中的菊粉多糖并加以利用。在好氧培養(yǎng)條件下，乙醇濃度在8 h時(shí)達(dá)到峰值(4.5%，V/V)，隨后降低，這與還原糖耗盡及有氧呼吸代謝有關(guān)(圖3f)。克魯維酵母是一種以呼吸代謝為主的酵母，好氧條件不利于乙醇生成和積累。為了有效提高乙醇產(chǎn)量，需要選擇合適的厭氧發(fā)酵時(shí)間。

圖3 好氧條件下菊芋汁培養(yǎng)基中Y179生長(zhǎng)及乙醇發(fā)酵Fig.3 Growth and ethanol production of Y179 with Jerusalem artichoke tuber juice medium under aerobic conditions.50 mL Jerusalem artichoke tuber juice medium containing 11%(W/V)total sugars in 250 mL Erlenmeyer flask was inoculated with 6%(V/V)inoculum of 17 h-precultured Y179 seed.The batch fermentation was conducted at 30°C with a stirring speed of 230 r/min under aerobic conditions.Biomass(a), pH(b), inulinase activity(c), total sugars(d), reducing sugars(e)and ethanol(f)in the fermentation broth of Y179 strain were assayed.All data are expressed as±s.of three independent experiments.

2.3 進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵時(shí)間對(duì) Y179利用菊芋原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

Y179種子液接入裝有10%(W/V)菊芋汁培養(yǎng)基的三角瓶，分別通氣好氧培養(yǎng)4 h、8 h、12 h后靜置(即厭氧發(fā)酵)，其生長(zhǎng)、糖消耗及產(chǎn)乙醇的結(jié)果如圖4所示。4 h好氧培養(yǎng)導(dǎo)致 24 h時(shí) Y179OD600僅為20，遠(yuǎn)低于8 h、12 h好氧培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的生物量。與結(jié)果2.2中不同，3種條件下發(fā)酵液pH值均出現(xiàn)單向降低趨勢(shì)，其中好氧培養(yǎng)4 h后進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵導(dǎo)致發(fā)酵液pH值緩慢降低，而8 h和12 h好氧培養(yǎng)條件產(chǎn)生的pH變化更快速，這可能與其生物量更高有關(guān)。與此對(duì)應(yīng)，僅4 h好氧培養(yǎng)下，Y179消耗總糖和還原糖的速率相對(duì)較慢，發(fā)酵液中乙醇濃度相應(yīng)逐步增加，而8 h和12 h好氧培養(yǎng)條件下總糖、還原糖及乙醇變化曲線則十分相似，變化速率均較快。乙醇曲線顯示 4 h好氧培養(yǎng)產(chǎn)生的乙醇濃度增加雖然相對(duì)緩慢，但發(fā)酵24 h時(shí)其乙醇濃度達(dá)到4%(V/V)，略高于8 h和12 h好氧培養(yǎng)條件產(chǎn)生的乙醇濃度(其峰值出現(xiàn)在 12 h處，約 3.6%(V/V))。結(jié)果提示縮短好氧培養(yǎng)時(shí)間，較早進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵在一定程度有助于乙醇產(chǎn)量提高。

2.4 種子液培養(yǎng)時(shí)間及初始總糖量對(duì) Y179產(chǎn)乙醇的影響

圖4 厭氧條件下菊芋汁培養(yǎng)基中Y179生長(zhǎng)及乙醇發(fā)酵Fig.4 Growth and ethanol production of Y179 with Jerusalem artichoke tuber juice medium under anaerobic conditions.50 mL Jerusalem artichoke juice medium containing 10%(W/V)total sugar in 250 mL Erlenmeyer flask was inoculated with 6%(V/V)inoculum of 17 h-precultured Y179 seed.The batch fermentation was conducted at 30°C with a stirring speed of 230 r/min under aerobic condition for 4 h(■), 8 h(◇), 12 h(▲)and then switched to stationary conditions.Biomass(a), pH(b), inulinase activity(c),total sugars(d), reducing sugars(e)and ethanol(f)in the fermentation broth of Y179 strain were assayed.

菊芋汁培養(yǎng)基中分別接入培養(yǎng)17 h、24 h和36 h的Y179種子液，好氧培養(yǎng)8 h后靜置厭氧發(fā)酵，其糖消耗及產(chǎn)乙醇結(jié)果如圖5所示。3種種子液產(chǎn)生的總糖、乙醇變化曲線基本相似，種子液培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生還原糖的能力越強(qiáng)，這與種子液中的菊粉酶量有關(guān)。種子液培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乙醇產(chǎn)量影響較小，初始總糖10%(W/V)時(shí)，不同培養(yǎng)時(shí)間種子液發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇濃度基本在 4%(V/V)左右。

圖5 種子液培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Y179利用菊芋汁發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.5 The effect of Y179 seed age on ethanol production.50 mL Jerusalem artichoke juice medium containing 10%(W/V)total sugars was inoculated with 6%(V/V)inoculum of 17 h(▲), 24 h(◇)and 36 h(■)precultured Y179 seeds.The batch fermentation was conducted at 30°C with a stirring speed of 230 r/min in 250 mL Erlenmeyer flasks under aerobic conditions for 8 h and then switched to stationary conditions.Total sugars(a), reducing sugars(b)and ethanol(c)in the fermentation broth were assayed.

圖6 初始總糖量對(duì)Y179利用菊芋培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.6 The effect of initial total sugars on ethanol production by Y179.50 mL Jerusalem artichoke juice medium containing 10%(W/V)total sugars supplemented with Jerusalem artichoke meal at 2.5 g(square), 5 g(triangle)and 10 g(circle)was inoculated with 6%(V/V)inoculum of the 24 h(solid icon)and 36 h(empty icon)precultured Y179 seeds.The batch fermentation was conducted at 30°C in Erlenmeyer flasks with a stirring speed of 230 r/min under aerobic conditions for 8 h and switched to stationary conditions.Total sugars(a), reducing sugars(b)and ethanol(c)in the fermentation broth were assayed.

通過菊芋汁中添加菊芋粉的辦法可以提高菊芋培養(yǎng)基中總糖含量，Y179菌株利用不同總糖含量菊芋培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)乙醇結(jié)果如圖6所示。初始總糖為13.75%(W/V)(50 mL 10%(W/V)菊芋提取液添加2.5 g菊芋粉)和17.5%(W/V)(50 mL 10%(W/V)菊芋提取液添加5 g菊芋粉)時(shí)，發(fā)酵24 h時(shí)總糖和還原糖耗盡，而初始總糖為25%(W/V)(50 mL 10%(W/V)菊芋提取液添加10 g菊芋粉)時(shí)，總糖和還原糖到48 h才基本耗盡。初始總糖越多乙醇產(chǎn)量相應(yīng)越高，初始總糖為25%(W/V)時(shí)，乙醇濃度在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到11%(V/V)。和圖5結(jié)果類似，種子液培養(yǎng)時(shí)間(24 h和36 h)對(duì)乙醇的產(chǎn)量影響不大，主要影響發(fā)酵液中還原糖的產(chǎn)生，對(duì)總糖消耗速度和乙醇產(chǎn)量影響相對(duì)較小。24 h和36 h種子液均保證了 Y719有效利用菊芋培養(yǎng)基中的菊粉多糖，發(fā)酵產(chǎn)生較高濃度的乙醇。

2.5 溫度對(duì)Y179發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

圖7 溫度和接種量對(duì)Y179利用菊芋培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響Fig.7 The effect of temperature and inoculation levels on ethanol production by Y179.50 mL Jerusalem artichoke juice medium supplemented with 10 g Jerusalem artichoke meal was inoculated with 6%(V/V)(empty)and 12%(V/V)(solid)inoculum of 36 h-precultured Y179 seeds, respectively.The batch fermentation was conducted in 250 mL Erlenmeyer flask at 30°C(square), 37°C(triangle)and 42°C(circle), with a stirring speed of 230 r/min under aerobic condition for 8 h and then switched to stationary conditions.Total sugars(a), reducing sugars(b)and ethanol(c)in the fermentation broth were assayed.

釀酒酵母的培養(yǎng)溫度一般不宜高于32℃，而鷹嘴豆孢克魯維酵母 Y179是一種可以在相對(duì)高溫下(如42℃)良好生長(zhǎng)的酵母。耐高溫的特性在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用方面具有很高價(jià)值。Y179菌株在30℃、37℃和42℃三種不同溫度條件下利用菊芋培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)乙醇結(jié)果如圖7所示。42℃和37℃發(fā)酵溫度在初期(12 h內(nèi))有助于糖消耗及乙醇產(chǎn)生，但對(duì)于乙醇終產(chǎn)量提高不利，特別是在42℃下，發(fā)酵液乙醇濃度在24 h時(shí)即達(dá)到峰值(10.3%，V/V)，隨后快速降低，其總糖、還原糖變化曲線也反映出42℃下糖未得到充分利用，殘?zhí)撬捷^高。37℃發(fā)酵溫度條件下，36 h時(shí)總糖基本耗盡，糖利用率較高，但乙醇產(chǎn)量略遜于30℃發(fā)酵溫度。30℃發(fā)酵乙醇產(chǎn)量相對(duì)最高，發(fā)酵48 h時(shí)乙醇濃度達(dá)到12%(V/V)，殘留總糖僅 0.48%(W/V)，糖醇轉(zhuǎn)化效率達(dá)到 74.4%。種子液接種量從6%(V/V)提高至12%(V/V)對(duì)于30℃和37℃發(fā)酵溫度條件下乙醇產(chǎn)量提高沒有明顯作用。

2.6 Y179于5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵產(chǎn)乙醇研究

在5 L發(fā)酵罐中對(duì)Y179酵母利用菊芋原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇進(jìn)行了測(cè)試。具體發(fā)酵過程如下：首先接種Y179于一級(jí)種子液YEPD培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)12 h，然后按10%(V/V)量接種于由40目菊芋干粉配制而成二級(jí)種子培養(yǎng)基(總糖含量5%(W/V))中，30℃、250 r/min搖床培養(yǎng)36 h。5 L發(fā)酵罐中裝載3 L完全由40目菊芋干粉配制而成(不添加任何其他物質(zhì))的發(fā)酵培養(yǎng)基，總糖含量約 22%(W/V)，85℃處理 30 min，冷卻后按 10%(V/V)量接入二級(jí)種子，30℃，不通氣，300 r/min攪拌發(fā)酵。結(jié)果如圖8所示，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，總糖濃度持續(xù)降低，而乙醇濃度則相應(yīng)逐步增加。發(fā)酵144 h時(shí)，乙醇濃度達(dá)到12.3%(V/V)，醪沼上清殘?zhí)?0.35%(W/V)，糖醇轉(zhuǎn)化效率達(dá)到 86.9%，糖利用率大于93.6%。

圖8 Y179在5 L發(fā)酵罐中利用菊芋原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇的研究Fig.8 Ethanol production by Y179 using raw Jerusalem artichoke tuber meal as sole medium component.Medium using raw Jerusalem artichoke meal as sole component with 22%(W/V)total sugars was inoculated with 10%(V/V)inoculum of 36 h-precultured Y179 seed.The batch fermentation was conducted at 30°C in a 5 L fermenter with a stirring speed of 300 rpm under anaerobic conditions.Total sugars(a), ethanol(b)and conversion efficiency(c)in the fermentation broth were assayed.

3 討論

目前全球燃料乙醇年產(chǎn)規(guī)模近3 000萬(wàn)t，而我國(guó)燃料乙醇生產(chǎn)能力僅100萬(wàn)t左右，主要以玉米、小麥等糧食作物為原料。而菊芋這種非糧植物耐貧瘠、易種植、成本低、含豐富的多聚果糖-菊粉，是極具開發(fā)價(jià)值的非糧型燃料乙醇生產(chǎn)原料。自20世紀(jì)80年代起，就有關(guān)于利用菊芋生產(chǎn)乙醇的研究報(bào)道[5,11]。鷹嘴豆孢克魯維酵母Y179是一株生長(zhǎng)密度高、分泌菊粉酶能力強(qiáng)的酵母，其菊粉酶基因已被本實(shí)驗(yàn)室克隆[12]。鑒于 Y179酵母高效分泌菊粉酶的特性，對(duì)其直接利用菊芋原料發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力進(jìn)行了初步研究。小規(guī)模搖瓶試驗(yàn)結(jié)果顯示，Y179酵母能夠在以菊芋汁或菊芋粉為唯一成分的培養(yǎng)基中良好生長(zhǎng)，分泌菊粉酶水解菊粉，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。種子液培養(yǎng)時(shí)間及接種量對(duì) Y179酵母利用菊芋發(fā)酵產(chǎn)乙醇影響較小，說明發(fā)酵過程對(duì)種子液中的菊粉酶初始酶量依賴不強(qiáng)。而通氧量及溫度對(duì)乙醇產(chǎn)量影響相對(duì)較大?？唆斁S酵母是一種以呼吸代謝為主的酵母，厭氧有助于Y179酵母的發(fā)酵代謝進(jìn)行，研究結(jié)果證實(shí)縮短好氧培養(yǎng)時(shí)間，較早進(jìn)入?yún)捬鯛顟B(tài)可以一定程度提高乙醇產(chǎn)量。雖然Y179酵母可以在42℃等相對(duì)高溫條件下正常生長(zhǎng)，而且可以快速利用菊芋原料產(chǎn)生乙醇，但殘?zhí)橇看螅抢寐什桓?，發(fā)酵后期乙醇濃度明顯降低，這有可能與42℃下Y179酵母糖異生代謝有關(guān)，不利于乙醇積累。降低發(fā)酵溫度則明顯改善 Y179酵母糖利用能力及乙醇產(chǎn)量，雖然30℃發(fā)酵溫度下糖消耗及乙醇產(chǎn)生的速率相對(duì)較慢，但以乙醇參數(shù)衡量，效果最佳。通過增加菊芋培養(yǎng)基總糖濃度可以有效提高發(fā)酵液中乙醇產(chǎn)量，即使在搖瓶中發(fā)酵，乙醇濃度也可以達(dá)到11%～12%(V/V)。上述試驗(yàn)是在搖瓶中通過磁力攪拌控制瓶中通氣量，停止攪拌靜置制造相對(duì)厭氧狀態(tài)進(jìn)行的，當(dāng)在菊芋汁中添加菊芋干粉以增加總糖濃度時(shí)，靜置狀態(tài)會(huì)影響原料的充分利用。為了便于操作和參數(shù)控制，特別是提高菊芋原料糖利用效率，設(shè)計(jì)了在5 L發(fā)酵罐中Y179酵母利用菊芋粉原料發(fā)酵試驗(yàn)。研究結(jié)果顯示Y179酵母可以高效利用菊芋原料，糖化和發(fā)酵同步進(jìn)行生產(chǎn)乙醇，乙醇濃度、糖醇轉(zhuǎn)化效率等指標(biāo)較搖瓶中均有較明顯改善。這一菊芋乙醇生產(chǎn)方法特點(diǎn)在于采用具有分解利用菊粉能力的單一酵母菌株糖化和發(fā)酵同步進(jìn)行生產(chǎn)乙醇，工藝簡(jiǎn)單不容易染菌，有利于發(fā)酵參數(shù)控制，而且發(fā)酵液僅由菊芋粉配制，不需添加其他任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可減低乙醇生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。研究報(bào)道多株克魯維酵母能夠利用菊粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，25～29 h內(nèi)乙醇濃度達(dá)到 6%～7%(V/V)，糖醇轉(zhuǎn)化效率79.0%～87.4%(V/V)[11]，更多的相關(guān)研究多采用混合菌株發(fā)酵，如以菊芋為原料，利用黑曲霉和釀酒酵母混合發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[7,13]；或以二步法生產(chǎn)乙醇，先用菊粉酶處理菊芋提取液后，再利用釀酒酵母以糖化后的菊芋提取液為發(fā)酵液生產(chǎn)乙醇[14]。

雖然初步研究顯示 Y179酵母可以直接利用菊芋原料發(fā)酵生產(chǎn)濃度大于12%(V/V)的乙醇，但發(fā)酵周期較長(zhǎng)，糖醇轉(zhuǎn)化效率相對(duì)傳統(tǒng)采用的釀酒酵母略低，因此相關(guān)的生產(chǎn)工藝還需要進(jìn)一步完善提高，為生物乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一條新途徑。

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Simultaneous saccharification and fermentation of Jerusalem artichoke tubers to ethanol with an inulinase-hyperproducing yeast Kluyveromyces cicerisporus

Jing Yu, Jiaxi Jiang, Yongqiang Zhang, Hong Lü, Yuyang Li, and Jianping Liu
State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

Received:May 20, 2010;Accepted:June 23, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2007AA02Z107), Shanghai Major Basic Research Program(No.05JC14001).

Corresponding author:Jianping Liu.Tel/Fax: +86-21-65643465; E-mail: jpliu@fudan.edu.cn國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2007AA02Z107)，上海市基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.05JC14001)資助。