杜然，李十中，章曉慶，王莉

清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084

兼性厭氧復(fù)合菌群H纖維素降解和產(chǎn)乙醇能力及生態(tài)組成初探

杜然，李十中，章曉慶，王莉

清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084

通過限制性培養(yǎng)條件和連續(xù)繼代培養(yǎng)，篩選獲得了一組具有高效穩(wěn)定降解纖維素能力的復(fù)合菌群 H。該菌群在傳代30代以上仍能保持各項性狀穩(wěn)定，其工作pH為6～9，3 d可以完全降解置于100 mL PCS緩沖液培養(yǎng)基中的濾紙，發(fā)酵液中能夠檢出1.54 g/L乙醇。通過16S rDNA擴(kuò)增和DGGE的方法，對菌群在不同階段的微生物組成進(jìn)行了研究，確定了琥珀酸嗜熱梭菌Clostridium thermo succinogene、產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium straminisolvens和紫色板藍(lán)根梭菌Clostridium isatidis等多種可直接實現(xiàn)纖維素到乙醇轉(zhuǎn)化的菌株。菌群通過菌種之間的協(xié)同作用，共同維持了體系的穩(wěn)定及降解能力的穩(wěn)定。明確菌系的組成，對于進(jìn)一步研究菌群降解機(jī)理、優(yōu)化菌群和提高乙醇產(chǎn)率意義重大。

纖維素降解，微生物菌群，乙醇生產(chǎn)

Abstract:The recalcitrance of lignocellulosic biomass makes its hydrolysis by cellulases less effective, and the consolidated bioprocessing(CBP)strategy that combines enzyme production, cellulose hydrolysis and fermentation, particularly the synergetic role of different microbes in attacking cellulose component could be a solution.In this article, a facultative anaerobe microbial consortium named H was isolated, which exhibited high stability even after 30 subcultures, with pH ranging from 6 to 9.Within three days, 0.5 g filter paper immerged in 100 mL PCS buffer was completely degraded, and 1.54 g/L ethanol was produced,correspondingly.Further analysis on the component of the microbe consortium was carried out though 16S rDNA and DGGE, andClostridium thermosuccinogene,Clostridium straminisolvensandClostridium isatidisthat can directly convert cellulose to ethanol were identified, indicating thatClostridiumspp.played important role in cellulose degradation through the synergistic coordination of different species, and the characterization of the consortium will benefit the analysis of the underlying mechanisms as well as the optimization of the CBP process for more efficient cellulose degradation and ethanol production.

Keywords:cellulose degradation, microbe consortium, ethanol production

中國是農(nóng)業(yè)大國，秸稈壘木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的保有量驚人。據(jù)統(tǒng)計，每年僅農(nóng)作物秸稈生產(chǎn)量高達(dá)7億多噸，農(nóng)作物加工廢棄物，如稻殼、玉米芯和甘蔗渣等估計總量在1億噸以上[1-2]。若能通過生物手段將其轉(zhuǎn)換為可發(fā)酵糖類，再進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)以纖維素乙醇為代表的第二代生物燃料，對于解決能源危機(jī)和環(huán)境問題有重大意義。纖維素乙醇目前主流的研究趨勢主要分為篩選更高效的纖維素酶，采用菌群的方式進(jìn)行纖維素和乙醇的同步發(fā)酵，以及CBP技術(shù)。

目前生產(chǎn)纖維素酶的主要方法是利用單一菌株發(fā)酵以提取其中的纖維素酶[3-5]。但是由于單菌發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶系配比不夠理想，于是有科學(xué)家提出復(fù)合菌的思路，如Thierie等[6]提出的采用數(shù)株梭菌組合形成的復(fù)合菌系，崔宗均等[7]提出的MC1復(fù)合菌系等。這些復(fù)合菌系是將已知的多種纖維素降解單菌進(jìn)行簡單的組合，沒有考慮到不同菌之間的協(xié)同互補(bǔ)與抑制關(guān)系，因而其降解纖維素效率并不高。采用人工合成的同時具有纖維素糖化和乙醇轉(zhuǎn)化能力的菌群也同樣存在上述問題。本課題組以前人原生態(tài)分離高效菌群的研究為基礎(chǔ)，結(jié)合中藥理論“君臣佐使”原理進(jìn)行了具有纖維素降解并生產(chǎn)乙醇能力的天然混合菌群篩選，并采用定向限制性培養(yǎng)的方式進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)的簡化[8]。采用該種方法獲得的混合菌群，不同菌在群落中各司其職，相互協(xié)作，具有較寬的工作溫度和 pH區(qū)間，極高的穩(wěn)定性和抗逆性，同時保持了較強(qiáng)的纖維素降解能力[9]和一定的乙醇轉(zhuǎn)化能力。本文報道了一組兼性厭氧的高效穩(wěn)定的纖維素分解菌群 H降解纖維素及產(chǎn)乙醇的性能，并對菌種的組成進(jìn)行了初步的研究，為進(jìn)一步研究其協(xié)同作用機(jī)理和優(yōu)化菌群奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

樣品分別取自天津河?xùn)|區(qū)郊區(qū)、河南省鄭州市郊區(qū)、山東濟(jì)寧市任城區(qū)、內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣。

篩選培養(yǎng)基成分[10]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，濾紙 5 g，微量元素液(ZnSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，CuSO4·5H2O，CoSO4·7H2O，Na2B4O7·10H2O，NaMoO4·2H2O，F(xiàn)eSO4)0.5 mL，蒸餾水 1 000 mL，pH 8.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌群篩選方法

取5 g土壤樣品接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中，當(dāng)其中濾紙完全崩解后，再按10%的接種量進(jìn)行傳代，如此進(jìn)行繼代培養(yǎng)50代以后進(jìn)行研究。

1.2.2 纖維素分解活性的測定[11]

CMC 糖化力法：取 1%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液 3.8 mL作為底物(用 pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制)，加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液0.2 mL，在50℃反應(yīng)30 min，加入1 mL DNS，1 mL 2 mol/L NaOH，沸水浴10 min，于540 nm測定還原糖量。以1 mL粗酶液反應(yīng)1 min釋放1 μmol葡萄糖所需酶量定義為1個酶活力單位(IU)。

葡聚糖外切酶活力單位的測定：0.2 mL酶液與1.8 mL 1 mg/mL pNPC(對硝基苯纖維二糖苷)溶液(用 pH 8.0的 Tris-HCl緩沖液配制)在 50℃反應(yīng)30 min。加入2 mL 10%的NaCO3終止反應(yīng)。然后在420 nm處測定消光值。

1.2.3 失重率的測定[11]

將0.5 g的濾紙(或其他纖維素物質(zhì))作為唯一碳源制作100 mL PCS，接種5 mL H菌液，50℃靜止培養(yǎng)，5 000 r/min 離心，用鹽酸和硝酸的混合液多次清洗沉淀以消除菌體[6]，然后 105℃烘干后稱重，計算失重量和失重率。

1.2.4 菌群生長過程中pH變化監(jiān)測

采用德國MERCK 1.09543.0001精密pH試紙進(jìn)行測定。

1.2.5 菌群DNA提取、16S rDNA PCR擴(kuò)增及序列分析

菌群DNA提取采用Bio-red土壤基因組提取試劑盒提取菌群總DNA。

16S rDNA PCR擴(kuò)增采用文獻(xiàn)[12]所述方法。

DGGE分析使用 DcodeTM Universal Mutation Detector System(BIO-RAD Laboratories，Hercu les，CA，USA)。操作步驟在Muyzer 等[13]的基礎(chǔ)上改良，見文獻(xiàn)[14]。引物 357F-GC-clamp：5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCC TACGGGAGGCAGCAG-3′和 518R：5′-ATTACCGCG GCTGCTGG-3′進(jìn)行16S rDNA的V3可變區(qū)擴(kuò)增。優(yōu)化后的PCR程序為95℃預(yù)變性4 min；95℃變性50 s，52℃退火45 s，72℃延伸45 s，25個循環(huán)；之后72℃延伸10 min。切膠回收純化后，電泳檢測，之后通過DGGE電泳進(jìn)行條帶分離，分離后切膠回收，再采用引物：357F：5′-CCTACGGGAGGCAGC AG-3′和 518R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′擴(kuò)增出的16S rDNA PCR產(chǎn)物連接T載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，進(jìn)行克隆驗證后，挑選單菌落送上海生工北京測序部測序，將測序結(jié)果在NCBI中比對。

1.2.6 濾紙降解液組成分析

采用島津GC/MS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，數(shù)據(jù)庫為Nist database。氣相色譜柱采用Varian色譜柱CP-Wax 57 CB。檢測樣品為菌群發(fā)酵第3天的發(fā)酵液，采用高速離心的方法除去細(xì)胞、蛋白等碎片，取上清液進(jìn)行TIC全譜檢測。氣相升溫程序為50℃初溫，以10℃每分鐘的速度升溫至160℃，保持7 min。質(zhì)譜離子源溫度200℃，接口溫度200℃，載氣為氦氣。

2 結(jié)果與分析

2.1 H菌群發(fā)酵動力學(xué)研究

圖1表明了菌群降解濾紙過程中內(nèi)切酶、外切酶、pH和失重率的變化趨勢。pH首先出現(xiàn)一個短暫的下降階段，在16 h時達(dá)到最低7，之后逐漸上升到7.5，至24 h時再次下降，直至60 h時到達(dá)最低點(diǎn)6.8，之后呈現(xiàn)持續(xù)增高趨勢；失重率呈現(xiàn)快速升高趨勢，至60 h左右保持穩(wěn)定，失重率達(dá)到90%以上。經(jīng)歷了最初接種帶來的波動后，內(nèi)外切酶酶活變化大致呈正態(tài)分布曲線，在60 h達(dá)到最高值，并維持較高酶活至90 h，在此階段2種酶均保持了較高的酶活，此后酶活均開始呈下降趨勢。通過對pH和酶活變化的分析，可以一定程度上反映不同菌之間的相互協(xié)調(diào)關(guān)系[15]。

研究表明，在0～18 h之間pH呈下降趨勢至最低點(diǎn) 6.8，酶活開始上升，失重率也隨之升高，在12 h后，隨著葡聚糖內(nèi)切酶、外切酶酶活的快速升高，失重率呈現(xiàn)加速升高的趨勢。但pH在24 h到達(dá)最高點(diǎn) 7.5后出現(xiàn)了快速下降的趨勢，并在酶活最高點(diǎn)附近達(dá)到最低點(diǎn)，原因可能是纖維素降解菌株在菌群中占據(jù)了主導(dǎo)地位，伴隨菌體的大量生長和產(chǎn)酶高峰的到來，纖維素快速轉(zhuǎn)化為發(fā)酵糖類并在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了乙酸等代謝產(chǎn)物，從而導(dǎo)致pH值出現(xiàn)明顯的下降。在2種酶酶活達(dá)到最高點(diǎn)時，濾紙逐步耗盡，失重率不再變化[16-17]。之后pH穩(wěn)定上升，酶活開始下降。分析其原因應(yīng)當(dāng)是隨著纖維素的耗盡，培養(yǎng)基中碳源匱乏導(dǎo)致菌體生長變緩進(jìn)入衰退期，進(jìn)而產(chǎn)酶下降，隨著菌體的大量死亡裂解，造成pH值出現(xiàn)升高的趨勢，即菌群中菌生長狀態(tài)的變化和代謝產(chǎn)物的變化共同作用導(dǎo)致了菌群特有的pH變化趨勢。另一方面，未經(jīng)過任何改造或者培養(yǎng)條件優(yōu)化的情況下，該菌群的內(nèi)切酶活性最高可達(dá)1.93 IU，外切酶可以達(dá)到3.6 IU，充分說明了該菌群在降解纖維素中的高效性及其進(jìn)一步研究的價值。

圖1 菌群H在生長過程中內(nèi)切酶、外切酶酶活、pH和失重率的動力學(xué)曲線Fig.1 The kinetic curves of the endoglucanase, exonglucanase, pH, cell concentration and the degradation ratio of cellulose in the growing period of the microbial consortium H.

2.2 濾紙降解液組分分析

通過氣質(zhì)聯(lián)用檢測，獲得了如圖2所示的色譜圖。

圖2 第3天發(fā)酵液氣質(zhì)檢測色譜圖Fig.2 GCMS chromatogram of the fermentation broth at the 3rd day.

經(jīng)過質(zhì)譜圖的比對，保留時間1.747 min處的峰為乙醇峰，乙醇含量約為 1.54 g/L，保留時間6.565 min、8.058 min、8.798 min和9.323 min處峰分別為乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸。該檢測結(jié)果證明了菌群在具有高效纖維素降解能力的同時，部分菌株可以利用纖維素降解產(chǎn)生的可發(fā)酵糖或者纖維素降解的部分中間產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇，即具有一步法生產(chǎn)纖維素乙醇的能力。同時，乙酸等其他有機(jī)酸的積累解釋了在酶活不斷升高過程中 pH持續(xù)下降的現(xiàn)象。若能通過優(yōu)化菌群的結(jié)構(gòu)提高可以利用纖維素生產(chǎn)乙醇的菌株比例，降低纖維素向乙酸等有機(jī)酸的轉(zhuǎn)化量，并通過馴化、人工合成等方式提高菌群的纖維素降解能力，則有望可以利用菌群進(jìn)行纖維素乙醇的一步法生產(chǎn)。

2.3 菌群組成研究

通過DGGE電泳分離，獲得了如圖3所示的電泳條帶。

圖3 H全基因組16S rDNA的V3可變區(qū)DGGE電泳圖(左條帶所示為菌群培養(yǎng)36 h時16S rDNA的V3可變區(qū)電泳圖譜；右條帶為菌群培養(yǎng)72 h時16S rDNA的V3可變區(qū)電泳圖譜。限于切膠儀器分辨率，分別選取了其中的8條和10條條帶切膠進(jìn)行測序分析)Fig.3 Electrophoretogram of the 16S rDNA V3 variable region of the genome of the microbial consortium H.The left and right bands were results of the samples collecting at the fermentation time 36 h and 72 h, respectively, and the bands numerated were selected for further analysis.

表1 菌群培養(yǎng)36 h和72 h時16S rDNA的V3可變區(qū)DGGE條帶序列比對后相似性結(jié)果Table 1 Alignment sequencing results of the DGGE bands of 16S rDNA V3 regions obtained at 36 h and 72 h

通過選擇，我們分別在A和B上切取較清晰并已經(jīng)充分分離的8條和10條條帶，進(jìn)行處理獲得序列信息后在 NCBI中比對，將獲得的結(jié)果中相似性最高的菌種信息列表如表 1所示，通過比對可以發(fā)現(xiàn)，在菌群可檢出的菌株中，以梭菌為優(yōu)勢菌群，由于梭菌多為厭氧和兼性厭氧類型，整個菌群也具有了兼性厭氧的特性。梭菌在纖維素降解方面的研究開展的十分廣泛，已有眾多文獻(xiàn)報道了梭菌在降解纖維素方面的優(yōu)勢，這就解釋了菌群具有較強(qiáng)的纖維素降解能力[18-24]。從組成上可以看出，除了具有纖維素降解能力的梭菌存在外，菌群中又輔以其他的或具有纖維素降解活性或不具有該活性的菌株，推測是由于這些菌株的存在，使菌群中的諸多菌相輔相成，共同作用成為了一個相對穩(wěn)定的體系，進(jìn)而使整個菌群具有了較強(qiáng)的抗逆性和環(huán)境適應(yīng)性。同時，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，諸如Clostridium thermosuccinogene、Clostridium straminisolvens、Clostridium isatidis[19,21-22]在降解纖維素的同時都會伴有代謝產(chǎn)物乙醇的生成，再結(jié)合對發(fā)酵液組分分析獲得的乙醇相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)一步驗證了菌群利用纖維素一步法生產(chǎn)乙醇的可能性。另外部分菌株在生長過程中產(chǎn)生的表面活性劑類代謝產(chǎn)物也會一定程度上促進(jìn)纖維素的降解[25-26]。

另一方面，通過對比表中不同時間的組成情況可以看出，即使對于一個穩(wěn)定的菌群，其在不同階段的菌種組成也是不盡相同的，在不同的階段，隨著培養(yǎng)基中成分的變化，菌群中的組成也隨之變化，依據(jù)之前的酶活曲線，當(dāng)達(dá)到降解最高峰，即酶活達(dá)到最高時，菌群中的優(yōu)勢菌群為梭菌，由此可以推測，在菌群中起到主要的纖維素降解作用的菌應(yīng)當(dāng)是梭菌。由于梭菌主要進(jìn)行的是厭氧發(fā)酵，因而其糖代謝主要產(chǎn)物為乙醇或者乙酸，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙醇和乙酸等會在體系中大量積累，正如氣質(zhì)檢測所示，在發(fā)酵液中檢出的主要組分為乙醇和乙酸。

3 結(jié)論

本課題組利用傳統(tǒng)中藥“君臣佐使”原理，采用限制性繼代培養(yǎng)方法，構(gòu)建并優(yōu)化得到傳代穩(wěn)定、纖維素降解能力強(qiáng)的兼性厭氧菌群 H，濾紙經(jīng)其降解72 h后失重率高達(dá)90%，內(nèi)切酶活性達(dá)1.93 IU，外切酶活性達(dá)3.6 IU。在發(fā)酵過程中，不同階段占據(jù)優(yōu)勢的菌種是變化的，當(dāng)具有高效纖維素降解能力的梭菌成為優(yōu)勢菌后，達(dá)到了最高的纖維素酶酶活。同時，兼性厭氧菌群H具有一定的乙醇生產(chǎn)能力，經(jīng)測定，在發(fā)酵第3天，發(fā)酵液中乙醇的積累量達(dá)到 1.54 g/L的濃度，顯示了其在一步法 CBP(Consolidate bioprocessing)發(fā)酵產(chǎn)乙醇方面的應(yīng)用前景。

在之后的研究中還需要利用蛋白組學(xué)分析獲得的關(guān)于纖維素降解相關(guān)酶類信息更一步的解釋菌群降解纖維素的優(yōu)勢，與基因組學(xué)獲得的菌群組成信息進(jìn)行交互驗證，從而可以更有效地探索菌群優(yōu)化和簡化的途徑，實現(xiàn)利用菌群進(jìn)行一步法生產(chǎn)纖維素乙醇。

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Ran Du, Shizhong Li, Xiaoqing Zhang, and Li Wang
Institute of Nuclear and New Energy Technology, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Received:May 24, 2010;Accepted:June 18, 2010

Supported by:Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period(No.2006BAD07A01).

Corresponding author:Shizhong Li.Tel: +86-10-62772123; Fax: +86-10-80194050; E-mail: szli@tsinghua.edu.cn“十一五”國家科技支撐計劃(No.2006BAD07A01)資助。