楊榮艷，王倩，劉曉秋，華會明*

（1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009；3.四平市食品藥品檢驗所，吉林 四平 136000）

清毒祛癆丸的薄層色譜鑒別及沒食子酸的含量測定

楊榮艷1，3，王倩2，劉曉秋1，華會明1*

（1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210009；3.四平市食品藥品檢驗所，吉林 四平 136000）

目的：建立清毒祛癆丸的鑒別和含量測定方法。方法：用TLC對玄參、黃芪、連翹、地榆進行鑒別；用HPLC測定沒食子酸的含量。結(jié)果：薄層鑒別斑點清晰；沒食子酸平均加樣回收率為98.7%，RSD＝1.2%。結(jié)論：鑒別重復(fù)性好，專屬性強，含量測定方法簡便、準確，可用于清毒祛癆丸的質(zhì)量控制。

清毒祛癆丸；TLC鑒別；HPLC測定；沒食子酸

清毒祛癆丸是四平結(jié)核病醫(yī)院多年臨床經(jīng)驗方，由地榆、黃芪、玄參、連翹、桔梗等20味藥組成，用于治療各型肺結(jié)核，淋巴結(jié)核，結(jié)核胸膜炎，腹膜炎，腦膜炎，腎結(jié)核，骨結(jié)核等結(jié)核病。該丸劑是水蜜丸，臨床療效顯著。但目前尚缺乏有效的質(zhì)量控制方法，為了有效控制清毒祛癆丸的質(zhì)量，保證其臨床療效，本文采用TLC對方中具有抑菌解毒、治癆殺蟲、利水滲濕、排膿生肌、補氣生津功效的藥材玄參、地榆、黃芪、連翹進行鑒別，獲得滿意結(jié)果；沒食子酸是地榆的指標性成分，具有抗菌、抗病毒、抗真菌作用，并有抗炎癥、抗腫瘤、抗過敏、抗誘變的作用，因 《中國藥典》2005版沒有收載HPLC測定地榆中沒食子酸的含量，所以本文建立了HPLC測定制劑中沒食子酸的含量，結(jié)果表明方法簡便、快速、準確。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010AHT型高效液相色譜儀（島津）；CLASSVP色譜工作站；UV-260可見-紫外分光光度計；紫外檢測器，AE240電子分析天平；LC-250超聲清洗器，功率250W，頻率50kHZ；純水器（德國）。

1.2 試藥

清 毒 祛 癆 丸 （批 號 20090901，20090902，20090903，四平結(jié)核病醫(yī)院提供）。沒食子酸對照品（批號 110831-200302）、哈巴俄苷對照品（批號111730-200604）、連翹苷對照品（批號 110821-200609）、黃芪甲苷對照品（批號0781-200311）均購自中國藥品生物制品檢定所，市售硅膠G板（上海盛亞化工有限公司，批號20090306），D101型大孔樹脂（天津市光復(fù)精細化工研究所，批號20090107）。

乙腈、甲醇均為色譜純（天津康科德科技有限公司），其他試劑均為分析純。水為實驗室自制的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 玄參的鑒別 取本品25g，研細，加甲醇50mL，浸泡1h后，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25mL，微熱使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次30mL，棄去乙醚液，再用醋酸乙酯振搖提取3次，每次30mL，棄去醋酸乙酯液，繼續(xù)用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇2mL使溶解，作為供試品溶液。另取哈巴俄苷對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例，同法制備缺玄參陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述3種溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（16∶4∶1）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照不干擾測定，見圖1。

2.1.2 黃芪的鑒別 取本品22g，研細，加甲醇60mL，回流提取3h，提取液蒸干，加水30mL，使溶解，用水飽和乙醚液提取4次，每次30mL，棄去乙醚液，用水飽和正丁醇提取3次，每次30mL，合并提取液，回收正丁醇液至干，殘渣加水5mL使溶解，上已處理好的 D101型大孔吸附樹脂柱（長16cm，內(nèi)徑1.5cm），以水100mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇140mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇180mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水飽和正丁醇20mL使溶解，用正丁醇飽和氨試液提取3次，每次30mL，棄去，再用正丁醇飽和水30mL提取2次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例，同法制備缺黃芪的陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述3種溶液各4μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

圖1 清毒祛癆丸中玄參TLC圖

圖2 清毒祛癆丸中黃芪TLC圖

2.1.3 連翹的鑒別 取本品24g，研細，加石油醚（30～60℃）50mL，密塞，超聲處理15min，濾過，棄去石油醚，殘渣揮干，加甲醇50mL，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25mL微熱使溶解，加醋酸乙酯振搖提取3次，每次30mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘渣加30%乙醇5mL使溶解，通過D101型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5cm，柱高10cm），用30%乙醇50mL洗脫，棄去洗液，再用稀乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取連翹苷對照品，加甲醇制成每1mL含0.25mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例，同法制備缺連翹陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述3種溶液各4μL，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（17∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖3。

2.1.4 地榆的鑒別 取本品24g，研細，加水100mL，煮沸30min，放冷，離心10min，取上清液，用鹽酸飽和的乙醚振搖提取2次，每次30mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例，同法制備缺地榆陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各5μL，對照品溶液2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯（水飽和）-醋酸乙酯-甲酸（6∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖4。

圖3 清毒祛癆丸中連翹TLC圖

圖4 清毒祛癆丸中地榆TLC圖

2.2 沒食子酸含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（1∶99），流速：1.0mL·min－1，檢測波長：272nm，柱溫：30℃，進樣量：10μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)P2O5干燥12h后的沒食子酸對照品適量，加水制成10μg·mL－1的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10%鹽酸溶液20mL，加熱回流3h，放冷，濾過，濾液置100mL量瓶中，用水適量分數(shù)次洗滌容器和殘渣，洗液濾入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性制劑及陰性對照液的制備 按處方組成比例制備缺地榆陰性制劑，再按供試品溶液的制備方法，制備地榆陰性對照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 在選定的色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果沒食子酸與其相鄰峰之間分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05，陰性樣品不干擾測定。理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計算均不低于8 000，HPLC圖見圖5。

圖5 清毒祛癆丸HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 取沒食子酸對照品約10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別精密量取沒食子酸對照品儲備液 0.1，0.3，0.5，0.8，1.0，1.5mL至10mL量瓶中，分別加水至刻度，搖勻，制成沒食子酸標準系列濃度溶液。分別精密吸取上述溶液各10μL進樣，在上述色譜條件下進行HPLC分析，以沒食子酸峰面積Y對濃度X（μg·mL－1）回歸分析，得回歸方程：Y＝3.2×104X+1 430.1，r＝0.999 9，結(jié)果表明沒食子酸在2.12～31.8μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，室溫放置，于0，3，6，9，12h分別進樣，按上述色譜條件分析，記錄沒食子酸峰面積，計算RSD＝1.4%。表明沒食子酸樣品溶液至少在12h內(nèi)基本穩(wěn)定穩(wěn)定。

2.2.8 精密度試驗 取沒食子酸對照品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，計算RSD＝0.8%。

2.2.9 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號樣品（批號20090901）6份，照 “2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算RSD＝1.5%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗 取己知含量的本品粉末（批號20090901）6份，每份約1g，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品溶液，按 “2.2.3”供試品溶液的制備項下方法操作，在上述色譜條件下進樣分析，計算平均回收率，結(jié)果見表1。

表1 沒食子酸加樣回收率試驗

2.2.11 樣品的測定 按供試品制備方法，每批樣品制備兩份，測定沒食子酸的含量，結(jié)果20090901，20090902，20090903批清毒祛癆丸中沒食子酸含量分別為 0.192，0.215，0.176 mg·g－1。

3 討論

清毒祛癆丸為中藥大復(fù)方制劑，成分復(fù)雜，各成分之間干擾較嚴重，通過多次試驗篩選出合理的供試品溶液制備方法和色譜分離系統(tǒng)，對其中主要藥味玄參、黃芪、連翹、地榆進行鑒別，并對地榆中的沒食子酸進行含量測定，經(jīng)過3批樣品測定表明，該方法簡便易行，薄層色譜斑點分離清晰，重現(xiàn)性好，陰性對照無干擾，可以作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

3.1 薄層色譜條件考察

3.1.1 玄參 在玄參的薄層色譜鑒別中，參照了《中國藥典》（2005年版）的薄層色譜條件［1］，在供試品處理步驟中增加了用乙醚和醋酸乙酯萃取過程，以除去一些脂溶性成分的干擾，并增加水飽和的正丁醇提取，以凈化供試品溶液，試驗結(jié)果斑點清晰，陰性無干擾。

3.1.2 黃芪 在黃芪的薄層色譜鑒別中，參照了《中國藥典》（2005年版）［2］，但供試品處理步驟中改用大孔吸附樹脂柱代替 《中國藥典》記載的中性氧化鋁柱，又考察以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液、氯仿-甲醇-正丁醇-水（2∶1∶4∶2）10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，結(jié)果前者薄層效果優(yōu)于后者，薄層斑點更加清晰，專屬性強，陰性對照無干擾。

3.1.3 連翹 在連翹薄層色譜鑒別中［3］，由于背景干擾較大，為除去干擾，供試品處理步驟中增加了石油醚脫脂，使背景干擾可以消除。又考察了D101型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5cm，柱高10cm）、聚酰胺柱（14～30目，3g，內(nèi)徑1～1.2cm，用水50mL預(yù)洗）兩種色譜柱，試驗結(jié)果表明D101型大孔樹脂柱處理的薄層效果優(yōu)于聚酰胺柱，斑點清晰，專屬性強，陰性對照無干擾。

3.1.4 地榆 在地榆的薄層色譜鑒別中［1］，展開缸預(yù)平衡15min，水飽和的甲苯需放置過夜后使用，薄層效果最佳。

3.2 高效液相色譜條件考察

沒食子酸的含量測定的色譜條件［4］，考察了不同色譜柱Zorbax SB－C18柱（250mm×4.6mm，5μm）和Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），結(jié)果表明用Diamonsil C18柱分離度較好?？疾炝瞬煌鲃酉嗟谋壤八岫葘Ψ蛛x度和峰形的影響：0.1%磷酸-乙腈（75∶25）、0.1%磷酸-乙腈（85∶15）、0.1%磷酸-乙腈（99∶1）、0.05%磷酸-乙腈（85∶15）、0.05%磷酸-乙腈（99∶1），結(jié)果表明 0.05%磷酸-乙腈（99∶1）最理想，不僅使色譜峰峰形好，而且與相鄰雜峰的分離度均大于1.5。設(shè)定恒定柱溫時，色譜峰的保留時間幾乎相差不大，若不設(shè)柱溫時，溫度差異會影響色譜峰的保留時間的變化。

3.3 沒食子酸檢測波長的選擇

取一定濃度的對照品溶液，用紫外分光光度計在200～400nm波長進行光譜掃描，結(jié)果在217和272nm處分別有最大吸收，但在272nm處色譜峰峰形更理想，與雜峰分離度更好，故選定272nm為檢測波長。

［1］國家藥典委員會.中國藥典中藥材薄層色譜彩色圖集［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：206，220.

［2］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：76-77.

［3］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：212.

［4］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：117.

TLC Identification and Determination of Gallic Acid in Qingdu Qulao Pill

Yang Rongyan1，3，Wang Qian2，Liu Xiaoqiu1，Hua Huiming1
（1.Shengyang Pharmaceutical University，Shengyang Liaoning110016，China；2.China Pharmaceutical University，Nanjing Jiangsu210009，China；3.Siping City Institute for Food and Drug Control，Siping Jilin136000，China）

Objective：To establish identification and determination method of Qingdu Qulao Pill.Methods：TLC was employed to identify four crude herbal elements in Qingdu Qulao Pill and the content of gallic acid was determined by HPLC.Results：The spot developed on TLC was fairly clear.The average recovery of gallic acid was 98.7%with RSD 1.2%.Conclusion：The identification methods are reproducible and specific and the determination method is simple and accurate，which can be used for the quality control of Qingdu Qulao Pill.

Qingdu Qulao Pill；TLC；HPLC

*華會明，E-mail：huimhua＠163.com

2010-04-22）