趙鈺嵐，徐玨，許傳蓮

浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)與分子酶學(xué)研究室，杭州 310018

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

人源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-C結(jié)構(gòu)域在畢赤酵母中的表達(dá)

趙鈺嵐，徐玨，許傳蓮

浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)組學(xué)與分子酶學(xué)研究室，杭州 310018

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (ACE，EC3.4.15.1) 在調(diào)節(jié)血壓方面具有重要作用，研究證實，ACE-C結(jié)構(gòu)域是體內(nèi)使血管緊張素I (AngI) 分解的主要活性位點。PCR擴(kuò)增ACE-C結(jié)構(gòu)域基因片段，克隆至分泌表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，陽性克隆再次電轉(zhuǎn)，用G418篩選高拷貝的酵母菌落進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，獲得0.5 g/L的蛋白表達(dá)量及7.178 U/mL的酶活力。經(jīng)Ni+親和層析純化，獲得純度大于97%的目的蛋白。Captopril對酶的抑制試驗證明ACE-C結(jié)構(gòu)域可望成為新一代抗高血壓藥物ACE抑制劑篩選的理想酶靶。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，催化結(jié)構(gòu)域，畢赤酵母，卡托普利

Abstract:Angiotensin I-converting enzyme (ACE, EC3.4.15.1) plays an important role in regulating blood pressure. The C-domain of ACE has been identified as the main catalytic site of angiotensin I cleavageinvivo. The ACE gene fragment of the C-domain was amplified by PCR and cloned into the pPIC9K secretory expression plasmid. The recombinant plasmid was transformed intoPichia pastorisstrain GS115. Positive clones were selected and subject to electroporation. Antibiotic G418 was used for the screening of multicopy inserts. After optimization of the expression system, the protein yield reached 0.5 g/L by flask-shaking culture fermentation, and enzyme activity reached 7.178 U/mL in the fermentation supernatant. The purity of the target protein obtained was 97% after Ni+affinity chromatography. Enzyme inhibitory activity assay using Captopril showed that it is promising to use ACE-C domain as new generation of target for screening ACE inhibitor antihypertensive drugs.

Keywords:angiotensin converting enzyme, catalytic domain,Pichia pastoris, Captopril

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (Angiotensin-converting enzyme，ACE) 是一種通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，參與血管緊張素II (Ang II)的生成和緩激肽 (BK) 的失活過程，對血壓調(diào)節(jié)，腎臟和心血管功能起關(guān)鍵作用的鋅離子依賴蛋白水解酶[1-5]。研究發(fā)現(xiàn)，ACE由兩個同源的活性結(jié)構(gòu)域 (C-結(jié)構(gòu)域和 N-結(jié)構(gòu)域) 組成，C-結(jié)構(gòu)域主要與 AngII 的生成相關(guān)，N-結(jié)構(gòu)域主要涉及出血調(diào)節(jié)[6-7]。體內(nèi)實驗表明，N-結(jié)構(gòu)域?qū)ρ獕旱恼{(diào)節(jié)沒有顯著影響，因此，ACE-C結(jié)構(gòu)域與全長序列ACE生成Ang II的能力幾乎相同[8]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑 (ACEI) 是臨床主要降壓藥物。目前，ACEI的設(shè)計均以全長序列 ACE為靶蛋白，這種相對非選擇性的ACEI在抑制AngⅡ生成的同時也抑制了緩激肽的降解，易產(chǎn)生咳嗽、腎功能不全等副作用[9]。而ACE-C結(jié)構(gòu)域的特異性抑制劑在有效抑制 AngⅡ生成的同時，又不完全抑制緩激肽的降解，穩(wěn)定緩激肽濃度，能夠有效減輕不良反應(yīng)。最近在收縮前豬冠狀微動脈模型中采用新一代ACE-C結(jié)構(gòu)域特異性抑制劑 (RXPA380) 和ACE-N結(jié)構(gòu)域抑制劑 (RXP407)，該抑制劑是在這兩種區(qū)域之間結(jié)構(gòu)差異的基礎(chǔ)上設(shè)計的，更具選擇性，在增強(qiáng)安全性的同時，改善了對不同生理過程的控制[10-13]。靶向ACE-C結(jié)構(gòu)域的ACEI藥物有望成為降血壓藥物的新選擇。

目前，用于 ACEI藥物篩選的酶靶主要是提取自豬腎、兔肺的天然ACE全酶。本研究采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，以完整的人源ACE開放閱讀框為模板，克隆了 ACE胞外的 C結(jié)構(gòu)域，實現(xiàn)了具有活性的ACE-C結(jié)構(gòu)域可溶性表達(dá)，并通過Captopril對其酶活性的抑制分析，為ACE-C結(jié)構(gòu)域特異性抑制劑篩選提供了新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1基因、菌株與試劑

Pichia pastoris菌株GS115、大腸桿菌DH12S、pPIC9K質(zhì)粒為本實驗室保存。含完整人源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ORF的質(zhì)粒GC-T7349購于廣州復(fù)能基因公司。EcoRⅠ、NotⅠ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，TaqDNA聚合酶，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) (低) 為TaKaRa公司產(chǎn)品。KOD-Plus-DNA Polymerase為日本 TOYOBO公司產(chǎn)品。普通質(zhì)粒小提試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) (MarkerⅢ，D15000) 為上海天根生物工程有限公司產(chǎn)品。膠回收試劑盒購自博大泰克。酵母提取物 (Yeast extract) 購自O(shè)xoid公司。蛋白胨 (Polypepton) 購自日本Nihon Seiyaku公司。YNB購自 Amresco公司。Captopril、Hippuryl-His-Leu acetate salt (HHL) 購自美國 Sigma公司。Hippuric acid馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品為Alfa Aesar公司產(chǎn)品。生物素 Biotin為 BBI公司產(chǎn)品。層析介質(zhì) Ni+Sepharose High Performance購自Amersham公司。DNA測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.2PCR引物

所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。5′端引物 Primer1：5′-GGGGAATTCTCCCAACAG GTGACAGTCAC-3′ (下劃線為EcoRⅠ酶切位點)；3′端引物 Primer2：5′-GGGCGGCCGCTTAATGATG ATGATGATGATGGGAGTTCGGCGTCCAGTTGT-3′(下劃直線為NotⅠ酶切位點；下劃波浪線為 6個(CAT) 的His標(biāo)簽；黑體為引入的終止密碼子)。

1.1.3培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：YPD (10%酵母抽提物，20%蛋白胨，20%葡萄糖)；

生長培養(yǎng)基：BMGY (10%酵母抽提物，甘油適量，20%蛋白胨，1 mol/L磷酸鹽緩沖液，13.4%YNB，4×10?5%生物素)；

表達(dá)培養(yǎng)基：BMMY (10%酵母抽提物，甲醇適量，20%蛋白胨，1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，13.4%YNB，4×10?5%生物素)。

1.2 方法

1.2.1pPIC9K-ACE-C載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒GC-T7349為模板，上下游引物擴(kuò)增ACE的C結(jié)構(gòu)域片段，擴(kuò)增條件為：94℃熱變性2 min；94℃15 s，47℃30s，68 ℃ 2 min ，25個循環(huán)；68℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過回收純化以后，用EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切，連接入pPIC9K載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH12S，提取陽性轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒pPIC9K-ACE-C，做酶切鑒定。

1.2.2重組質(zhì)粒的電擊轉(zhuǎn)化及高抗性轉(zhuǎn)化子的篩選

限制性內(nèi)切酶SacⅠ將測序鑒定正確的高濃度重組質(zhì)粒線性化，與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞GS115混合轉(zhuǎn)入0.2 cm電轉(zhuǎn)杯，電擊4 s左右，參數(shù)為：電壓1 500 V；電容25 μF；電阻200 ?。電擊后，經(jīng)孵育，涂布于MD平板，30℃培養(yǎng)2 d，至單克隆轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定。陽性菌落制備成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行2次電轉(zhuǎn)，刮下MD板上生長的菌落分別涂布于含抗生素G418 3 mg/mL的YPD平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d，篩選抗性強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子。

1.2.3重組質(zhì)粒在酵母GS115中的表達(dá)與條件優(yōu)化

從含3 mg/mL G418的YPD平板上挑取單克隆接種于 25 mL BMGY培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng) 2 d至OD600= 2～6，離心收集菌體重新懸浮于 200 mL BMMY培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，每隔24 h添加甲醇至終濃度為1%，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，分別在誘導(dǎo)后0、6、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84、96 h取樣，取上清進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，并用Bradford法測總蛋白濃度和酶活力。

從含3 mg/mL G418的YPD平板上挑取單克隆接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d至OD600=2～6，離心收集菌體重新懸浮于BMMY (不添加甲醇與磷酸緩沖液) 培養(yǎng)基，2 mL分裝于滅菌試管，一組添加磷酸緩沖液 (pH 6.0) 和不同濃度的甲醇至終濃度分別為0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%、2.25%；一組添加甲醇至終濃度為1%和不同pH值的磷酸緩沖液，pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。30℃誘導(dǎo) 2 d，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用Bradford法測總蛋白濃度和酶活力。

重組酵母在 25 mL BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600= 2～6，離心收集菌體，重懸于200 mL BMMY培養(yǎng)基，30℃誘導(dǎo)96 h (甲醇誘導(dǎo)濃度1.75%) 后，上清進(jìn)行12% SDS-PAGE、Western blotting鑒定蛋白質(zhì)，Bradford法測定蛋白濃度，薄層凝膠掃描分析蛋白質(zhì)純度。

1.2.4表達(dá)蛋白的純化

甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的ACE-C分泌到畢赤酵母胞外，培養(yǎng)基于12 000 r/min離心30 min去除菌體，上清調(diào)pH值至7.4，NaCl濃度至500 mmol/L。取處理后的上清 600 mL以 3 cm/min的線速度加入Ni+-NTA層析柱中，收集流出液，得蛋白峰 1。首先用30 mL 上樣緩沖液洗滌，得蛋白峰2，然后用含20 mmol/L、40 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液分步洗滌 3次，每次 3 mL，分別得到蛋白峰 3、4。用含200 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫5次，收集流出液共15 mL，得蛋白峰5。最后將經(jīng)Ni+-NTA層析柱得到的蛋白液用10 kDa透析袋除鹽12 h，收集后真空干燥。SDS-PAGE檢測純化效果。

1.2.5表達(dá)蛋白的活性測定

三肽HHL (馬尿酰-組氨酰-亮氨酸，N-Hippuryl-His-Leu) 在 ACE的催化作用下快速分解產(chǎn)生馬尿酸和二肽His-Leu，可通過HPLC測定馬尿酸的生成量來評價ACE的酶活性。0.5 mL離心管中加入70 μL Tris緩沖液 (100 mmol/L Tris-HCl；300 mmol/L NaCl；10 μmol/L ZnCl2，pH 8.3)，10 μL 培養(yǎng)基上清于 37℃恒溫 5 min，隨后加入 12.5 mmol/L HHL 20 μL，37℃恒溫 30 min后沸水浴 10 min，15 000×g高速離心10 min，轉(zhuǎn)移80 μL上清于HPLC管用作進(jìn)樣分析。HPLC檢測條件為：0.1%乙酸溶液-乙腈(95.5∶4.5)，維持0～5 min；在5～35 min流動相比例線性改變至 (85∶15)；35～65 min流動相比例線性改變至 (68∶32)，流速1.0 mL/min；檢測波長330 nm；進(jìn)樣量20 μL。使用Agilent ZORBAX SB-C18分析柱 (4.6 m×150 mm，5 μm)。馬尿酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算馬尿酸的生成量。酶活力定義：在上述條件下每分鐘水解HHL生成1 nmol/L馬尿酸所需要的酶量為一個單位 (U)。

1.2.6Captopril對表達(dá)產(chǎn)物ACE C-端結(jié)構(gòu)域的抑制作用

精密稱取2.17 mg Captopril，去離子水溶解并定容至10 mL容量瓶，即為1 mmol/L Captopril母液。稀釋母液濃度至 102、10、1、10?1、10?2、10?3μmol/L。取 10 μL Captopril稀釋液與 20 μL Tris緩沖液 (pH 8.3)、50 μL 0.5 μmol/L 酶液混勻，37℃孵育5 min后加20 μL HHL啟動反應(yīng)。按“1.2.5”方法測定不同濃度的 Captopril對 ACE-C結(jié)構(gòu)域的抑制活性?？瞻讓φ占?0 μL去離子水，計算IC50值，即抑制50% ACE-C結(jié)構(gòu)域酶活性的Captopril濃度。

計算公式：Inhibition (%) = (a?b)/a×100%。

a為空白對照組中馬尿酸的峰面積 (mAU×s)；b為添加Captopril組中馬尿酸的峰面積 (mAU×s)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pPIC9K-ACE-C載體的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒抽提，用 Primer1/Primer2引物進(jìn)行PCR鑒定，得到約2 kb的片段 (圖1)，與目的基因大小 (1 915 bp) 相符，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，出現(xiàn)約9 kb和2 kb片段，與載體 (9.3 kb) 和目的基因 (1 915 bp) 條帶大小相符，說明表達(dá)載體構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒的測序結(jié)果 (測序圖略) 也與NCBI的RNA庫中查得的序列相符，未發(fā)生堿基突變。

2.2 酵母重組子的鑒定和篩選

畢赤酵母GS115為His?菌株，不能合成組氨酸，因此只有含HIS4基因的重組質(zhì)粒整合入GS115后，與宿主進(jìn)行互補(bǔ)，才能在不含組氨酸的培養(yǎng)基MD板上生長。SacⅠ線性化后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GS115后，產(chǎn)生 His+Mut+重組子，挑取單克隆用GS115基因組上 5′AOX1引物和 3′AOX1引物進(jìn)行PCR鑒定 (圖2)，可見兩條帶，一條為目的基因約2.5 kb，另一條為AOX基因約2.2 kb，野生菌GS115擴(kuò)增出一條帶，為AOX基因，空載體對照擴(kuò)增出一條大小約500 bp的帶。為增加目的基因在酵母基因組中的拷貝數(shù)，提高表達(dá)量，對陽性重組子進(jìn)行了2次電轉(zhuǎn)，并用高濃度G418篩選高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子，最終獲得能抗G418 3 mg/mL的酵母轉(zhuǎn)化子。

2.3 ACE-C結(jié)構(gòu)域的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

2.3.1甲醇濃度對蛋白表達(dá)量和酶活力變化的影響

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定與雙酶切鑒定Fig.1 PCR amplication of ACE-C gene and restrication analysis of the expression vector pPIC9K-ACE-C. M: DNA marker; 1: pPIC9K-ACE-C/EcoRⅠ+NotⅠ; 2: PCR of ACE-C gene.

本菌種為Mut+型，對甲醇的消耗能力較強(qiáng)。結(jié)果如圖3所示，甲醇濃度1.75%時，總蛋白量和酶活力都是最高的。

2.3.2pH條件對蛋白表達(dá)量和酶活力變化的影響

pH值降低會影響細(xì)胞的膜通透性，進(jìn)而影響蛋白的分泌。結(jié)果如圖4所示，不同pH值對酶活力的影響較大；酸性環(huán)境明顯不利于ACE-C結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，在pH 5.5時，蛋白表達(dá)量和酶活力最高。

圖2 PCR鑒定畢赤酵母整合Fig.2 PCR analysis of recombinant strain. M: DNA marker;1,2: the expression strain of pPIC9K; 3,4: wild strain; 5: the expression strain of pPIC9K-ACE-C.

圖3 不同甲醇濃度誘導(dǎo)下的總蛋白和酶活力變化Fig.3 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation supernatant induced by different concentration of methanol.

圖4 不同pH條件下甲醇誘導(dǎo)的總蛋白和酶活力變化Fig.4 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation supernatant of different pH condition.

2.3.3誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)量和酶活力變化的影響

pH 5.5、1.75%甲醇誘導(dǎo)條件下發(fā)酵96 h，不同時間段的總蛋白和酶活力變化結(jié)果如圖5所示。

2.3.4重組蛋白的鑒定

上述結(jié)果可見pH 5.5和1.75%甲醇終濃度誘導(dǎo)96 h后能獲得高表達(dá)有活力的酶蛋白，表達(dá)總蛋白為0.5 g/L，平均酶活力為5.235 U/mL，分子量約為97.2 kDa。12% SDS-PAGE和Western blotting鑒定結(jié)果見圖6和圖7。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化

表達(dá)上清液經(jīng)Ni+Sepharose High Performance親和柱一步純化后，用40 mmol/L咪唑濃度的洗脫液洗脫獲得高純度的目的蛋白，結(jié)果見圖 8。薄層凝膠掃描分析蛋白質(zhì)純度為97%。

2.5 卡托普利對表達(dá)產(chǎn)物 ACE-C結(jié)構(gòu)域的抑制作用

應(yīng)用 ACE抑制劑卡托普利對表達(dá)產(chǎn)物 ACE-C結(jié)構(gòu)域的抑制活性進(jìn)行考察，其濃度與抑制率關(guān)系

圖5 不同時間段的總蛋白和酶活力變化Fig.5 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation supernatant at different stages after induced in culture.

圖6 酵母菌表達(dá)重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression. M: protein marker; 1: control of pPIC9K; 2: ACE-C domain.

圖7 ACE-C結(jié)構(gòu)域的Western blotting鑒定Fig.7 Western blotting analysis of the expression. M: protein marker; 1: control of pPIC9K; 2: ACE-C domain.

圖8 ACE-C結(jié)構(gòu)域純化的SDS-PAGE分析Fig.8 Purification of the ACE-C domain. M: protein marker;1: ACE-C domain.

圖9 Captopril對ACE-C結(jié)構(gòu)域的抑制Fig.9 Inhibition of ACE-C domain by captopril.

如圖9所示，卡托普利的濃度范圍在10?8～10?9mol/L之間濃度與抑制率成線性關(guān)系。計算 IC50值為7.38×10?9mol/L。

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)藥物在高血壓的治療中表現(xiàn)突出，廣泛用于臨床的兩大類是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和非肽類血管緊張素受體拮抗劑 (沙坦類)，這兩類藥物是近年來發(fā)展較快的降壓藥物。目前國內(nèi)外心血管藥品市場中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑藥物主要有 Enalapril、Benaze-pril、Benazepril、Lisinopril、Quinapril，它們具有卓越的療效和良好的耐受性，遺憾的是存在不良反應(yīng)，尤其干咳現(xiàn)象較為突出。

因為傳統(tǒng)的 ACEI能夠抑制強(qiáng)效的血管收縮物質(zhì)血管緊張素的生成，同時也能抑制了緩激肽的降解。濃度升高的緩激肽雖然起到了舒張血管的作用，但也會引起干咳等不良反應(yīng)。在對ACE的兩個結(jié)構(gòu)域的研究中發(fā)現(xiàn)針對ACE-C結(jié)構(gòu)域的抑制劑可以抑制血管緊張素II的生成，但又不能完全抑制緩激肽的降解，有望減輕藥物帶來的副作用。

本實驗中克隆的ACE-C結(jié)構(gòu)域含有豐富的二硫鍵及糖基化位點，在大腸桿菌中表達(dá)不能正確折疊，形成無活性的包涵體[14-15]。本研究采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)后，成功并且高效地表達(dá)了ACE-C結(jié)構(gòu)域。表達(dá)策略主要包括：在外源蛋白基因的 5′端去掉了天然信號肽；采用pPIC9K載體上的a交配因子信號肽和KEX2酶切位點序列，它們可將外源蛋白分泌至胞外并將a交配因子信號肽切除；采用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切位點；在表達(dá)蛋白基因的3′端去掉了原蛋白的膜錨定區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，Tracy等實驗證實，3′端是否去掉ACE-C結(jié)構(gòu)域的膜錨定區(qū)，對增加分泌性 ACE-C結(jié)構(gòu)域的表達(dá)量有較大影響[16]；在 3′端增加了 His6-tag序列以便純化；在外顯子選擇方面采用了sACE與tACE共同的基因序列，以便更好地反映ACE整體特征；為提高外源蛋白表達(dá)量，用2次電轉(zhuǎn)來增加高拷貝菌株概率，篩選獲得高拷貝菌株。

對發(fā)酵誘導(dǎo)條件中 pH、甲醇誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時間的進(jìn)行優(yōu)化，使蛋白表達(dá)量增加到0.5 g/L，平均酶活力達(dá)到5.235 U/mL，最高酶活力達(dá)到7.178 U/mL，適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，由于搖瓶發(fā)酵導(dǎo)致的目的蛋白及蛋白酶活力的不穩(wěn)定有望在高密度發(fā)酵水平得到改善。由于外源蛋白融合了His6-tag，經(jīng)一步純化即可達(dá)到純度為97%?？ㄍ衅绽鳛橐种苿?biāo)準(zhǔn)品，考察了卡托普利對ACE-C結(jié)構(gòu)域的抑制動力學(xué)，不同文獻(xiàn)報道的卡托普利對 ACE的抑制活性各不相同，IC50值為 7.5×10?10～2.2×10?8mol/L[17]，這可能與不同的酶來源、不同的測試底物等因素有關(guān)。Nicolas等最新報道，在其發(fā)現(xiàn)的一系列次磷酸三肽化合物中，8F2化合物對ACE-C結(jié)構(gòu)域及ACE-N結(jié)構(gòu)域的Ki值分別為 6.5×10?10mol/L和 1500×10?10mol/L，顯示出良好的ACE-C結(jié)構(gòu)域選擇性，同時，對內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑也具有抑制作用[18]。8F2對ACE-C結(jié)構(gòu)域的IC50為7.31 nmol/L，半抑制濃度與卡托普利相接近；如能同時測定8F2與卡托普利對本研究所表達(dá)的ACE-C結(jié)構(gòu)域半抑制濃度，將更有意義。同時，由于次磷酸三肽分子量較卡托普利大，結(jié)構(gòu)較卡托普利復(fù)雜，作為臨床用藥，卡托普利無疑更具有優(yōu)勢。

綜上所述，ACE-C結(jié)構(gòu)域在畢赤酵母中的成功表達(dá)為ACE-C結(jié)構(gòu)域抑制劑的高通量篩選提供了特異性的酶靶。

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Expression of human angiotensin converting enzyme-C domain inPichia pastoris

Yulan Zhao, Jue Xu, and Chuanlian Xu

Laboratory of Proteomics & Molecular Enzymology,College of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou310018,China

Received:December 14, 2009;Accepted:March 22, 2010

Supported by:Key Project of Zhejiang Education Department (No. Z200804057), Project of Scientific and Technological Innovation Promotion for Student of Zhejiang Province (No. 14080131380912).

Corresponding author:Chuanlian Xu. Tel: +86-571-86843566; Fax: +86-571-86843745; E-mail: chuanlianxu@163.com

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