歐陽偉，王永山，周宇，張海彬，唐雨德

1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014

2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095

3 南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002

動(dòng)物及獸醫(yī)生物技術(shù)

傳染性法氏囊病病毒AH1株vp2基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與應(yīng)用

歐陽偉1,2，王永山1，周宇1,2，張海彬2，唐雨德3

1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014

2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095

3 南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002

將近期引起傳染性法氏囊病 (IBD) 免疫預(yù)防失敗的傳染性法氏囊病病毒 (IBDV)vp2基因，定向克隆入桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的供體質(zhì)粒pFastBacHTA中，構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-VP2，轉(zhuǎn)化Escherichia coliDH10Bac感受態(tài)，篩選重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2。用pBac-VP2轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒vBac-VP2。對重組桿狀病毒vBac-VP2感染的Sf9細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗(yàn) (IFA) 檢測，具有特異性熒光；用IBDV抗體夾心ELISA檢測，呈陽性反應(yīng)，抗原效價(jià)達(dá)到1.6×103；用Western blotting分析，在53 kDa處出現(xiàn)一條特異蛋白條帶；電鏡觀察，重組Vp2蛋白能夠自組裝成病毒樣顆粒，在感染細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了“包涵體樣”結(jié)構(gòu)。用HisTrap HP親和層析柱純化的重組Vp2蛋白作為包被抗原，建立的IBDV抗體間接ELISA檢測方法具有良好的特異性。用重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞裂解物，免疫2周齡SPF雞，一次免疫14 d后，ELISA檢測抗體效價(jià)為8×102，中和抗體效價(jià)為1106，攻毒實(shí)驗(yàn)的存活率為30%；二次免疫14 d后，ELISA抗體效價(jià)為3.2×103，中和抗體效價(jià)為2536，存活率為100%。在實(shí)驗(yàn)觀察7 d內(nèi)，重組Vp2蛋白免疫保護(hù)雞未顯任何臨床癥狀和病理變化，法氏囊/體重比高于對照組 (P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)制備的病毒樣顆粒重組Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和檢測試劑方面顯示出了應(yīng)用前景。

傳染性法氏囊病病毒，vp2基因，病毒樣顆粒，包涵體樣結(jié)構(gòu)，間接ELISA，免疫實(shí)驗(yàn)

Abstract:Protective immune response of the available IBD vaccine is insufficient to fully protect against the prevailing strain of the infectious bursal disease virus (IBDV). Such a vaccination escape IBDV field isolate idenfied from Anhui province of China inDecember 2007, where IBD broke out at 2 weeks post vaccination. The IBDVvp2gene was cloned into pFastBacHTA donor plasmid, followed by generation of the recombinant bacmid DNA pBac-VP2. The latter was used to transfect insect cell Sf9 with Lipofectamine to produce recombinant baculovirus vBac-VP2. The Sf9 cells infected with vBac-VP2 were stained positive against IBDV antibody using the indirect immunofluorescence assay (IFA), which was also confirmed by the detection of IBDV Vp2 protein in the infected Sf9 cells by IBDV sandwich ELISA. Western blotting revealed that the calculated protein of approximately 53 kDa was in the expressed in the insect cells. Moreover, virus-like particles (VLPs) and “inclusion body-like”structure in the infected Sf9 cells were observed under electron microscopy. We further developed an indirect ELISA for the detection of the IBDV antibodies,which was specific and sensitive. In addition, the lysates of vBac-VP2 infected cells was used to immunize 2-week-old SPF chickens,followed by challenging with the virulent IBDV, the survival rate was 30% at 14 days post primary immunization, however, the survival rate was 100% at 14 d after the booster vaccination. The ELISA antibody titers was up to 3.2×103and neutralization antibody titer was 2536, significantly higher than those of one-shot vaccination, 8×102and 1106, respectively. The immunized chickens did not show any clinical signs and histopathological changes of infection in 7-days trial time. The bursa/body-weight ratios were higher than those of the unimmunized control (P< 0.05). The virus-like-particle recombinant Vp2 protein expressed in insect cells promises to be a novel subunit vaccine and diagnostic reagent candidate for IBDV.

Keywords:infectious bursal disease virus,vp2gene, virus-like particles (VLPs), inclusion body-like structure, indirect ELISA,protection test

傳染性法氏囊病 (Infectious bursal disease，IBD) 是引起我國及世界養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重的主要傳染病之一。接種疫苗是預(yù)防該病最有效的方法，在上世紀(jì)80年代的中后期，在世界范圍內(nèi)爆發(fā)了在抗原性和致病性等方面與經(jīng)典毒株有很大差異的IBDV變異毒株，使養(yǎng)雞業(yè)遭受重創(chuàng)[1-5]。變異株和超強(qiáng)毒株 (vvIBDV) 的出現(xiàn)使該病的防控難度加大，IBD免疫預(yù)防失敗已成為禽病防控中的重要問題[4,6-8]。目前，使用的常規(guī)弱毒疫苗和滅活疫苗，其安全性和制造工藝仍存在不足：為預(yù)防變異毒株而采用中強(qiáng)毒力活疫苗存在著較大的生物安全問題，因?yàn)樵诓煌?IBDV毒株之間潛在著基因重配的可能，給該病的防控帶來隱患；滅活疫苗存在著抗原制備的困難；因此，在當(dāng)前IBD防控實(shí)際工作中，亟需免疫效力強(qiáng)、生物安全性高、并且針對當(dāng)前流行毒株的新型 IBD基因工程疫苗的問世。IBDV屬雙RNA 病毒科雙RNA病毒屬，基因組包括大 (A)小 (B) 2個(gè)片段，有5種病毒蛋白：Vp1、Vp2、Vp3、Vp4和Vp5。Vp2占病毒蛋白的51%，既是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，又是病毒的主要保護(hù)性抗原，與病毒中和抗體的誘導(dǎo)、抗原和毒力的變異以及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)等有關(guān)[1-2,9-10]。Vp2的高變區(qū)是病毒中和性單抗的結(jié)合必需區(qū)，該區(qū)的點(diǎn)突變是 IBDV抗原漂移、毒力變異進(jìn)而造成經(jīng)典疫苗株免疫失敗的主要原因。迄今，IBD基因工程疫苗研究均以vp2為靶基因，采用的表達(dá)系統(tǒng)包括：大腸桿菌[11]、酵母[12]、雞痘病毒載體[13]、桿狀病毒表達(dá)載體[14]、核酸疫苗[15]以及近期報(bào)道的多表位疫苗[16]等。目前IBD基因工程疫苗研究中的主要問題：或者是重組IBDV蛋白的表達(dá)量不夠高，或者是重組IBDV蛋白復(fù)性難度大，或者是源于一種毒株的重組蛋白不適用于其他變異毒株。因此，在vp2基因選擇、表達(dá)系統(tǒng)以及表達(dá)策略方面進(jìn)一步探索新的技術(shù)路線是十分必要的。近期，筆者對安徽省在2007年12月發(fā)生的兩起免疫失敗的IBDV野外毒株的vp2基因的分子特征進(jìn)行了分析，其vp2基因與當(dāng)時(shí)預(yù)防使用的疫苗毒株 (B87株) 的vp2基因序列有較大差異[17]，再次佐證了IBDV變異株的危害。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)針對 IBD基因工程疫苗研究中的主要問題，選用該vp2基因，運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將其在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，制備病毒樣顆粒重組 Vp2蛋白，研制新型高效IBD病毒樣顆?；蚬こ桃呙绾蜋z測試劑。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種與細(xì)胞

含有vp2基因的克隆質(zhì)粒pUC-VP2 (AH1) 系本實(shí)驗(yàn)室用RT-PCR方法從2007年12月在安徽境內(nèi)發(fā)生的IBD免疫預(yù)防失敗的病雞法氏囊組織中擴(kuò)增的vp2基因構(gòu)建[17]。含有 6×His標(biāo)簽的供體質(zhì)粒pFastBacHTA、含有Bacmid和Helper plasmid的E.coliDH10Bac、Sf9昆蟲細(xì)胞、E. coliTOP10均購自Invitrogen公司。IBDV 疫苗毒株B87雞胚成纖維細(xì)胞 (CEF) 適應(yīng)毒和9～10日齡SPF雞胚均由南京天邦生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑

雞抗IBDV高免血清系用IBD弱毒疫苗 (B87)多次免疫SPF雞獲得，用DEAE纖維素 (DE32) 純化；兔抗雞IgG抗體和HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、X-gal、IPTG均購自TaKaRa公司；BAC/PAC DNA Isolation Kit購自 Omega公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自 Invitrogen公司；胎牛血清、Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)vp2基因序列和供體質(zhì)粒pFastBacHTA表達(dá)閱讀框設(shè)計(jì)vp2基因擴(kuò)增引物：

重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒鑒定引物：

以上引物由Invitrogen公司合成。

1.4Vp2基因重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建

將克隆質(zhì)粒 pUC-VP2 (AH1) 和供體質(zhì)粒pFastBacHTA分別用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分別回收vp2和載體DNA片段，DNA膠回收試劑盒純化，T4 DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coliTOP10感受態(tài)細(xì)菌，涂布在用LB配制的1.5%瓊脂平皿上 (含氨芐青霉素100 mg/L)，37℃培養(yǎng) 14 h。挑單菌落接種入 LB (含氨芐青霉素100 mg/L)，振搖培養(yǎng)12 h，用MiniBEST 質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，獲得含vp2基因的重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-VP2。

1.5Vp2基因重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-VP2轉(zhuǎn)化E. coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞 (含 Bacmid DNA和 Helper plasmid)，在LB培養(yǎng)基中37℃，220 r/min，4 h，用LB 做一系列稀釋 (10?1、10?2、10?3)，涂布于 LB 配制的1.5%瓊脂平皿上 (含有50 mg/L卡那霉素、7 mg/L慶大霉素、10 mg/L四環(huán)素以及 100 mg/L X-gal和40 mg/L IPTG)，37℃培養(yǎng)16 h，挑白色單菌落，接種于含有3種抗生素 (50 mg/L卡那霉素、7 mg/L慶大霉素、10 mg/L四環(huán)素) 的LB中，37℃振搖培養(yǎng)16 h，用BAC/PAC DNA Isolation Kit提取重組Bacmid DNA，用vp2基因正向引物vp2F(36) 和M13/pUC通用下游引物 PCR鑒定重組 Bacmid DNA，獲得含vp2基因的重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pBac-VP2。

1.6Vp2基因重組桿狀病毒的獲得

在轉(zhuǎn)染前1天，用對數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞在 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制備單層細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，并用無血清無抗生素的Grace’s液洗滌細(xì)胞，然后用孵育好的 pBac-VP2-Lipofectamine2000混合物平鋪Sf9細(xì)胞單層，27℃培養(yǎng)5 h，棄去pBac-VP2-Lipofectamine2000混合物，每孔加入含10%血清及抗生素的 Grace’s完全培養(yǎng)液，置 27℃繼續(xù)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)同步設(shè)立用未插入外源基因片段的Bacmid質(zhì)粒和單用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染 Sf9細(xì)胞為對照；每日觀察，直到細(xì)胞病變達(dá)90%時(shí)，收集細(xì)胞及上清液，在Sf9昆蟲細(xì)胞上繼續(xù)傳代2次，獲得第3代重組桿狀病毒 (P3代)，進(jìn)行鑒定。

1.7Vp2基因重組桿狀病毒的鑒定

1.7.1IFA檢測

實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。將重組桿狀病毒 (P3代) 接種到Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清的培養(yǎng)液洗 2次，然后向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入?20℃預(yù)冷的無水乙醇1 mL/孔，4℃固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入40倍稀釋的雞抗IBDV高免血清，200 μL/孔，37℃孵育2 h，PBS洗滌5次，拍干；加入100倍稀釋的兔抗雞IgG抗體，200 μL/孔，37℃孵育1 h，PBS洗滌5次，拍干；加入50倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體工作液，200 μL/孔，37℃孵育 1 h，PBS洗滌 5次，置于熒光顯微鏡下觀察。同步設(shè)立無vp2基因的桿狀病毒 (Baculovirus) 感染 Sf9細(xì)胞和正常細(xì)胞為對照。

1.7.2夾心ELISA檢測

用包被液稀釋雞抗IBDV IgG至5 mg/L，然后包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，4℃過夜，PBST洗滌3次，每次5 min，拍干；用封閉液 (含10% FBS的PBST)滿孔封閉，37℃，2 h，PBST洗滌3次，每次5 min，拍干；加入超聲破碎好的P4代細(xì)胞，100 μL/孔，37℃，2 h，PBST洗滌3次，每次5 min，拍干；加入1∶1 000稀釋的 HRP標(biāo)記的雞抗 IBDV IgG，100 μL/孔，37℃，1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，拍干；顯色。實(shí)驗(yàn)同步設(shè)立陰性和空白對照。

1.7.3Western blotting分析

將P3代vBac-VP2感染的Sf9細(xì)胞、Bacmid轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞和正常的Sf9細(xì)胞用0.01 mol/L PBS (pH 7.2) 離心洗滌2次后，按原體積1%加入PBS重懸，3次凍融后，加入5×SDSLoading Buffer，按常規(guī)方法進(jìn)行12%分離膠和5%濃縮膠的SDS-PAGE電泳分析，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印完畢后，將硝酸纖維素膜用 5%脫脂奶粉 4℃封閉過夜，然后用一抗 (雞的 IBDV高免血清)、二抗 (HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體) 分別與之作用，DAB底物顯色，觀察特異蛋白條帶。

1.7.4電鏡觀察

用P3代vBac-VP2感染Sf9昆蟲細(xì)胞，待細(xì)胞完全病變之后，收集細(xì)胞，凍融3次，3 000 r/min離心30 min，取上清使用電鏡負(fù)染技術(shù)制片觀察。用同樣方法收集病變細(xì)胞，不凍融，3 000 r/min離心30 min沉淀細(xì)胞，2%戊二醛固定液固定，超薄切片，電鏡觀察，同時(shí)設(shè)立正常Sf9昆蟲細(xì)胞作空白對照。

1.8 重組Vp2蛋白的純化

取300 mL vBac-VP2感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，離心收集細(xì)胞，用12 mL結(jié)合緩沖液重懸，并加入20 μL 100 mmol/L PMSF，冰浴條件下超聲破碎至細(xì)胞懸液清亮，4℃、10 000 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片，取上清用0.45 μm孔徑濾膜過濾，然后按照HisTrap HP說明書純化重組Vp2蛋白。

1.9 重組Vp2蛋白的應(yīng)用

1.9.1IBDV抗體間接ELISA檢測方法的建立

用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將純化的重組Vp2蛋白稀釋至5 mg/L，包被ELISA板，100 μL/孔，4℃過夜；用PBST洗滌3次，每次2 min，拍干；每孔加入封閉液 (含 10% FBS 的 PBST) 300 μL，37℃，2 h；用PBST洗滌3次，每次2 min，拍干；加入待檢血清樣品，37℃，1 h；用PBST洗滌3次，每次2 min，拍干；加入HRP-標(biāo)記的兔抗雞IgG (1∶2 000)100 μL，37℃，1 h；用 PBST洗滌 3次，每次 2 min，拍干；加入顯色劑A液 (四甲基聯(lián)苯胺溶液)、B液(過氧化氫脲溶液) 液各 1滴，暗盒顯色；2 mol/L H2SO4終止，測A450值，判定結(jié)果。

1.9.2重組Vp2蛋白的免疫攻毒試驗(yàn)

將100只2周齡SPF雞 (購自南京天邦生物科技有限公司) 隨機(jī)分成 3組，隔離飼養(yǎng)：重組 Vp2蛋白加免疫佐劑組 60只，將重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物 (ELISA效價(jià)為1 600) 與等體積的免疫佐劑 (法國 SEPPIC公司 Montainde ISA 206 VG) 混合乳化，經(jīng)胸部肌肉注射，0.4 mL/只/次，第1次免疫14 d后進(jìn)行第2次免疫；單用免疫佐劑組20只，免疫程序與前者相同，只注射免疫佐劑，0.4 mL/只/次；空白對照組20只，不注射，只是與其他 2個(gè)實(shí)驗(yàn)組在同樣條件下飼養(yǎng)。全部的實(shí)驗(yàn)雞均在免疫實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)翅靜脈采血，并在免疫后每間隔7 d采血1次，分別測定抗體效價(jià)。

將采集的實(shí)驗(yàn)雞血清從1∶100開始進(jìn)行2倍比連續(xù)稀釋，用IBDV抗體間接ELISA檢測方法 (見1.9.1) 測定抗體效價(jià)。

將實(shí)驗(yàn)雞血清從1∶100開始進(jìn)行10倍比連續(xù)稀釋，各取100 μL，分別與等體積的IBDV B87細(xì)胞適應(yīng)毒稀釋物 (病毒含量200 TCID50/0.1 mL) 混合，置37℃反應(yīng)1 h，接種于含有CEF單層的96孔培養(yǎng)板中，100 μL/孔 (病毒含量 100 TCID50/孔)，每份待檢血清設(shè)4個(gè)重復(fù)；同時(shí)設(shè)立病毒對照、陽性血清對照、陰性血清對照、細(xì)胞對照。置37℃、5%CO2培養(yǎng)，每天觀察病變，記錄結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算出每個(gè)血清樣品的病毒中和抗體效價(jià)，計(jì)算幾何均數(shù) (GMT)，為該血清的病毒中和抗體效價(jià)。

第1次免疫14 d后，從3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中各取半數(shù)雞 (重組Vp2蛋白加免疫佐劑組30只、單用免疫佐劑組10只、空白對照組10只)，同時(shí)采用點(diǎn)眼、滴鼻、擦肛3種途徑人工感染IBDV強(qiáng)毒[16]，0.2 mL/只(病毒含量100 LD50)，攻毒后每日觀察試驗(yàn)雞的生長和發(fā)病情況，連續(xù)觀察7 d，記錄死亡數(shù)，及時(shí)解剖檢查病死雞法氏囊組織病變并取少許置于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察組織學(xué)變化。第7天捕殺存活雞，稱體重，檢查法氏囊病理變化并稱重；按以下公式分別計(jì)算各組試驗(yàn)雞的法氏囊/體重比 (BB比值)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 (F檢驗(yàn))。對3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的另半數(shù)雞進(jìn)行第2次免疫，14 d后同法攻毒。

法氏囊/體重比(BB比值) = 法氏囊重(g) ×1 000/試驗(yàn)雞體重(g)

2 結(jié)果與分析

2.1Vp2基因重組供體質(zhì)粒的鑒定

將構(gòu)建的供體質(zhì)粒 pFastBacHTA-VP2用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳可見兩條帶，分別約為1.4 kb與5.0 kb，與預(yù)期大小相符 (圖1)。

2.2Vp2基因重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

用重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA-VP2轉(zhuǎn)化E. coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑與三抗篩選，挑白色菌落克隆，用BAC/PAC DNA Isolation Kit提取重組Bacmind DNA，重組Bacmid DNA經(jīng)PCR鑒定 (引物為vp2基因正向引物vp2F(36) 和M13/pUC通用下游引物)，1%瓊脂糖凝膠電泳可見一條大小約為2 100 bp的條帶，與理論值2 092 bp相符，說明vp2基因已成功轉(zhuǎn)座入Bacmid DNA中 (圖2)。

圖1 pFastBacHTA-VP2的酶切圖譜Fig.1 Digestion map of pFastBacHTA-VP2. M: DNA marker;1, 2: pFastBacHTA-VP2 digested byEcoRⅠ andHind Ⅲ.

圖2 pBac-VP2的PCR分析圖譜Fig.2 PCR analysis of pBac-VP2. M: DNA marker; 1, 2:plasmid pBac-VP2.

2.3Vp2基因重組桿狀病毒的獲得

將鑒定好的pBac-VP2按Lipofectamine2000使用說明書轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，每天觀察病變，5 d后，轉(zhuǎn)染孔可見部分細(xì)胞變圓變大，第 6天細(xì)胞病變達(dá)90%以上，收集病變細(xì)胞及上清，1 500 r/min離心10 min，上清液即為含vp2基因的重組桿狀病毒vBac-VP2原液 (P1代)，繼續(xù)傳代2次，獲得高效價(jià)的重組桿狀病毒vBac-VP2 (P3代)。

2.4Vp2基因重組桿狀病毒的鑒定

2.4.1IFA檢測

在熒光顯微鏡下，可以看見感染P3代vBac-VP2病毒的 Sf9昆蟲細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而感染野生型桿狀病毒的細(xì)胞與正常的細(xì)胞則無熒光 (圖 3)。表明vp2基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。

2.4.2夾心ELISA檢測

用夾心ELISA檢測P4代vBac-VP2病毒細(xì)胞超聲裂解物，加入P4代樣品的孔，顯示陽性，抗原效價(jià)達(dá)到 1.6×103，表明vp2基因在昆蟲細(xì)胞中得到了高效表達(dá)。正常昆蟲細(xì)胞和PBST對照孔則均為陰性。

2.4.3Western blotting分析

對 P3代 vBac-VP2病毒細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行 SDSPAGE，用Western blotting分析，在53 kDa附近可見一條特異蛋白帶，表明重組 Vp2蛋白具有 IBDV抗原反應(yīng)性 (圖4)。

2.4.4電鏡觀察

用電鏡負(fù)染技術(shù)觀察，在P3代vBac-VP2病毒感染的昆蟲細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒，直徑約60 nm(圖 5A)；用 vBac-VP2病毒感染的病變細(xì)胞制備超薄切片，可發(fā)現(xiàn)由病毒樣顆粒在細(xì)胞中形成的“包涵體樣”結(jié)構(gòu) (圖5B)。

圖3 感染vBac-VP2的Sf9昆蟲細(xì)胞IFA檢測結(jié)果 (100×)Fig.3 Detection of Sf9 cells infected with vBac-VP2 by IFA (100×). (A) Normal Sf9 cells. (B) Sf9 cells infected with Baculovirus.(C) Sf9 cells infected with vBac-VP2.

圖4 感染vBac-VP2的Sf9細(xì)胞SDS-PAGE和Western blotting分析結(jié)果Fig.4 Analysis of vBac-VP2 infected Sf9 cells by SDS-PAGE and Western blotting. M: protein marker; 1: normal Sf9 cells (in SDS-PAGE); 2: Sf9 cells infected with vBac-VP2(in SDS-PAGE); 3: Sf9 cells infected with vBac-VP2 after ultrasonication (in SDS-PAGE); 4: purified Vp2 protein expressed in Sf9 cells(in SDS-PAGE); 5: normal Sf9 cells(in Western blotting); 6: Sf9 cells infected with vBac-VP2(in Western blotting).

圖5 感染vBac-VP2的Sf9細(xì)胞電鏡檢查結(jié)果Fig.5 Observation of Sf9 cells infected with vBac-VP2 by electron microscopy. (A) Virus-like particles (VLPs) were observed in the Sf9 cells infected with vBac-VP2 by negative staining of electron microscopy. (B) “Inclusion body-like”structure were observed in the Sf9 cells infected with vBac-VP2 by ultra-section of electron microscopy.

2.5 重組Vp2蛋白的純化

Sf9細(xì)胞表達(dá)的Vp2蛋白經(jīng)HisTrap HP親和層析柱純化后，進(jìn)行 SDS-PAGE，用凝膠圖像分析軟件BandScan5.0分析，重組Vp2蛋白的純度達(dá)80%(圖 4)。

2.6 重組Vp2蛋白的應(yīng)用

2.6.1IBDV抗體間接ELISA檢測方法的建立

用純化的重組 Vp2蛋白做包被抗原建立的IBDV抗體間接ELISA檢測，IBD疫苗 (B87株) 免疫 20 d后的雞血清 (陽性血清) 檢測孔A450值≥0.90，而 SPF雞血清、牛血清以及 PBST對照孔的A450值均為0.00，表明該ELISA抗體檢測方法具有良好的特異性 (表1)。

2.6.2重組Vp2蛋白的免疫攻毒試驗(yàn)

重組 Vp2蛋白加免疫佐劑組，隨著免疫時(shí)間和免疫次數(shù)的增加，免疫雞血清中IBDV的ELISA抗體與病毒中和抗體不斷上升 (圖 6)。第 1次免疫14 d后，重組Vp2蛋白加免疫佐劑組的ELISA抗體效價(jià)為800，病毒中和抗體效價(jià)為1 106，此時(shí)用IBDV強(qiáng)毒攻擊，在攻毒后的第2天開始有死亡，第3天死亡較多，至第7天攻毒雞的存活率為30%(9/30)；而單用免疫佐劑組與空白對照組 ELISA抗體效價(jià)和中和效價(jià)均小于100，用IBDV強(qiáng)毒攻擊，在攻毒后的第4天全部死亡。解剖檢查死亡雞的法氏囊腫大、出血、表面有膠凍樣分泌物 (圖 7)；病理組織學(xué)檢查可見法氏囊淋巴濾泡呈不同程度的萎縮、壞死，濾泡內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞破碎相多見，濾泡間質(zhì)增寬，有較明顯的間質(zhì)水腫 (圖8A)。同期正常飼養(yǎng)的對照雞生長正常，法氏囊組織也未見病理變化 (圖8 B)。第7天捕殺存活雞，各試驗(yàn)組的法氏囊/體重比 (BB值) 平均值分別為：重組Vp2免疫組3.68、單用免疫佐劑組2.51、空白對照組2.35。經(jīng)F檢驗(yàn)，重組Vp2免疫組與兩個(gè)對照組間均有顯著差異 (P＜0.05)，而兩個(gè)對照組之間差異不顯著 (P＞0.05)。

表1 IBDV抗體間接ELISA檢測結(jié)果Table 1 Detection of anti-IBDV antibodies by indirect ELISA

圖6 重組Vp2蛋白免疫雞IBDV抗體動(dòng)態(tài)Fig.6 Pattern of IBDV-antibody in chickens immunized with recombinant Vp2.

圖7 攻毒死亡雞法氏囊解剖檢查結(jié)果Fig.7 Bursa of dead chickens challenged with vIBDV.

圖8 實(shí)驗(yàn)雞法氏囊病理組織學(xué)檢查結(jié)果 (HE，200×)Fig.8 Tissue slices of bursas (HE, 200×). (A) Dead chicken.(B) Normal control.

第2次免疫14 d后 (從第1次免疫起28 d)，重組Vp2蛋白加免疫佐劑組ELISA抗體效價(jià)上升到3 200，病毒中和抗體效價(jià)為2 536，此時(shí)用IBDV強(qiáng)毒攻擊，存活率為100% (30/30)；單用免疫佐劑組與空白對照組ELISA抗體和中和抗體效價(jià)始終小于100，攻毒雞全部死亡。死亡雞的法氏囊均呈現(xiàn)以上病理變化。重組Vp2免疫組的法氏囊/體重比 (4.25) 與單用免疫佐劑組 (2.24) 和空白對照組 (2.29) 均差異顯著(P＜0.05)，而單用免疫佐劑組和空白對照組之間差異不顯著 (P＞0.05) (表2)。表明重組病毒樣顆粒Vp2蛋白免疫雞可以抵抗IBDV強(qiáng)毒攻擊。

3 討論

長期以來，對IBD采取了以疫苗免疫接種為主的綜合性防控措施，該病的大規(guī)模流行或爆發(fā)已得到了有效控制，但難以消除，其主要原因是 IBDV具有抵抗力強(qiáng)、抗原與毒力容易變異以及非雞禽鳥類可成為病毒攜帶者或貯存宿主等特點(diǎn)，使該病極易呈地方性流行，已成為禽病防控中的重要問題，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大、無法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)[17-20]。

病毒樣顆粒疫苗作為預(yù)防性疫苗具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)勢：不含病毒DNA，無感染性[21]；免疫原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫；穩(wěn)定性好，不易失活。顆粒疫苗作為一種新型的疫苗，不僅克服了傳統(tǒng)的弱毒疫苗和滅活疫苗的不足，也彌補(bǔ)了基因疫苗的不足，在許多傳染病的防控上顯示出了良好應(yīng)用前景。Antonis等[22]用在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的豬細(xì)小病毒vp2基因產(chǎn)物制備的病毒樣顆粒疫苗，在免疫佐劑的作用下，能在豬體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的血清抗體。

表2 重組Vp2蛋白的免疫攻毒試驗(yàn)Table 2 The protection test of chickens immunized with recombinant Vp2

本研究針對目前IBD基因工程疫苗研究中存在的主要問題，在目的基因選擇上，采用近期引起免疫失敗并具有完全的IBDV強(qiáng)毒分子特征的vp2基因，在表達(dá)系統(tǒng)上，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有與高等細(xì)胞類似的翻譯后修飾系統(tǒng)，可使外源基因表達(dá)產(chǎn)物具有天然的活性形式、表達(dá)產(chǎn)物可自組裝成病毒樣顆粒 (VLPs)、以及表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，將IBDV近期流行毒株的vp2基因在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。檢測證明，重組Vp2蛋白能夠自組裝成病毒樣顆粒，在感染細(xì)胞中形成“包涵體樣”結(jié)構(gòu)，細(xì)胞培養(yǎng)物的ELISA效價(jià)達(dá)到1.6×103，得到了高效表達(dá)。

為了評估該病毒樣顆粒重組Vp2蛋白的應(yīng)用前景，用重組Vp2蛋白作為IBDV抗體檢測抗原，建立了IBDV抗體間接ELISA檢測方法，檢測結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性。由于雞體內(nèi)不可能存在抗昆蟲細(xì)胞抗體，因此使用在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的病毒樣顆粒重組Vp2蛋白作為IBDV抗體檢測抗原研制IBD抗體檢測試劑盒可以有效地保證檢測方法的特異性。已有的研究表明，免疫效果和生產(chǎn)成本是影響獸用基因工程疫苗推廣應(yīng)用的主要因素，鑒于此，本實(shí)驗(yàn)簡化疫苗制備工藝，用重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞裂解物免疫SPF雞，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗IBDV的ELISA抗體與中和抗體，抵抗 IBDV強(qiáng)毒攻擊，免疫保護(hù)雞未顯任何臨床癥狀和病理變化，法氏囊/體重比高于對照組，具有成為新型IBD病毒樣顆?；蚬こ桃呙绲臐摿?。由于目前缺乏IBDV病毒樣顆粒重組Vp2蛋白免疫攻毒試驗(yàn)參考資料，本試驗(yàn)的免疫劑量和免疫途徑、IBDV攻毒時(shí)機(jī)和劑量都是根據(jù)作者自己的工作經(jīng)驗(yàn)初步確定的，因此，在免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果中，兩次免疫比一次免疫注射的保護(hù)率高，這表明對IBDV病毒樣顆粒重組Vp2蛋白的免疫劑量和免疫佐劑進(jìn)行優(yōu)化是必不可少的，該項(xiàng)工作正在進(jìn)行中。以上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的病毒樣顆粒重組Vp2蛋白在研制新型IBD基因工程疫苗和檢測試劑方面顯示出了應(yīng)用前景。

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Recombinant Vp2 protein of infectious bursal disease virus AH1 strain expressed in insect cells: a vaccine candidate

Wei Ouyang1,2, Yongshan Wang1, Yu Zhou1,2, Haibin Zhang2, and Yude Tang3

1Key Laboratory of Animal Diseases and Immunology,Ministry of Agriculture National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products,Institute of Veterinary Medicine,Jiangsu Academy of Sciences,Nanjing210014,China
2College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing210095,China
3Huadong Research Institute of Medical Biotechnics,Nanjing210002,China

Received:December 4, 2009;Accepted:March 26, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30571371), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Nos. BK2008352,BK2009041), Agriculture Science and Technology Innovation Foundation of Jiangsu Province (No. CX(08)106).

Corresponding author:Yongshan Wang. Tel: +86-25-84390339; E-mail: wangyongshan2001@yahoo.com.cn; wangys63@126.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 30571371)，江蘇省自然科學(xué)基金 (Nos. BK2008352, BK2009041)，江蘇省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新基金 (No. CX(08)106) 資助。