劉戈宇，柴團(tuán)耀，孫濤

中國科學(xué)院研究生院生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

綜 述

超富集植物遏藍(lán)菜對重金屬吸收、運(yùn)輸和累積的機(jī)制

劉戈宇，柴團(tuán)耀，孫濤

中國科學(xué)院研究生院生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

遏藍(lán)菜Thlaspi caerulescens可以在其地上部累積大量重金屬如鋅、鎘等，是公認(rèn)的超富集植物。由于該植物生物量小，不宜直接用于重金屬污染的土壤植物修復(fù)，而被廣泛作為一種模式植物來進(jìn)行重金屬富集機(jī)制研究。遏藍(lán)菜對重金屬離子的累積大致經(jīng)過螯合劑解毒、地上部長距離運(yùn)輸以及在液泡中的儲存等生理過程。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物體內(nèi)的金屬螯合劑——有機(jī)酸、氨基酸、植物絡(luò)合素(PCs)、金屬硫蛋白(MT) 和尼克煙酰胺NA等，區(qū)室化以及長距離運(yùn)輸相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白——ZIP (ZRT/IRT like protein)、CDF (Cation diffusion facilitator)、Nramp (Natural resistance and macrophage protein) 和HMA (Heavy metal ATPase) 等家族，以上各種基因、多肽與蛋白等共同參與了植物對金屬累積與耐受過程并發(fā)揮各自重要的作用。以下主要介紹了遏藍(lán)菜重金屬超富集相關(guān)的基因、多肽和蛋白，以及它們在重金屬螯合作用和運(yùn)輸過程中的功能。

遏藍(lán)菜，重金屬，富集，螯合，轉(zhuǎn)運(yùn)

Abstract:Thlaspi caerulescens, the famous model plant of heavy-metal hyperaccumulator, can uptake and accumulate large amount of heavy metals in its above-ground part of the plants. However, the very low biomass inThlaspi caerulescensmakes this plant unfit for direct application in phytoremediation. In recent years, there are many reports about the physiological and molecular characterization ofThlaspi caerulescensunder heavy metals stresses, including absorption, transport and intracellular detoxification processes (e.g., chelation and compartmentation). Research teams have conducted many studies of chelators in plants, such as organ acid, amino acid, phytochelatins, metallothioneins and nicotianamine, and so on. Several transport protein families, such as Zinc Regulated Protein, Cation Diffusion Facilitator, Natural Resistance and Macrophage Protein and Heavy Metal ATPase, play important role in short/long distance transport in the plant. In this review, we summarize the current knowledge of the physiological and molecular mechanisms of heavy metals accumulation inThlaspi caerulescens, with particular emphasis on the roles of transporters and chelatins in modulating plant heave-metal-stress responses.

Keywords:Thlaspi caerulescens, heavy metal, accumulation, chelation, transportation

近年來，隨著工業(yè)化進(jìn)程的不斷加劇，日益嚴(yán)重的重金屬污染已經(jīng)成為全球性的環(huán)境問題[1-2]。重金屬能夠通過食物、水以及空氣等途徑進(jìn)入人體并在體內(nèi)累積，對人類健康造成巨大的威脅。雖然一些重金屬如 Cu、Zn、Fe等是維持動、植物正常生理機(jī)能的重要元素，但是這些金屬元素的過量存在也會對組織器官造成毒害。在礦區(qū)附近，有些如菥蓂屬、鼠耳芥屬以及蕓薹屬等植物可以在含有高濃度Cd、Hg、Pb等重金屬的土壤中正常生長[3]。經(jīng)過分析研究，發(fā)現(xiàn)這些植物與同種其他非重金屬污染土壤中生長的植物相比，具有很強(qiáng)的重金屬耐性和超富集能力[4]。

遏藍(lán)菜Thlaspi caerulescens為菥蓂屬，是公認(rèn)的一種重金屬超富集植物。近年來基于它所具有的特殊重金屬耐性以及超富集機(jī)制，對其重金屬吸收累積機(jī)制方面進(jìn)行廣泛研究。關(guān)于遏藍(lán)菜的重金屬富集相關(guān)的最早報道源于 1865年，Sachs等發(fā)現(xiàn)遏藍(lán)菜T. caerulescens能夠在富含Zn的土壤中生長，而且體內(nèi)的Zn元素含量占植株總干重的17%[5]。而重金屬“超富集植物”(Hyperaccumulator) 定義則是最早由Brooks等于1977年提出，以Ni超富集植物為例，植物體內(nèi)Ni累積量大于1 000 mg/kg DW(Dry weight) 就稱為超富集植物[6]。人們通過對此類植物進(jìn)一步的研究和分析，逐漸完善了這一定義——植物葉片或地上部分 (干重) 中所含重金屬含量高于根部或地下部分，且分別含Cd達(dá)到100 mg/kg DW，Co、Cu、Ni、Pb達(dá)到1 000 mg/kg DW，Mn、Zn達(dá)到10 000 mg/kg DW以上的植物稱為超富集植物。遏藍(lán)菜是一種可富集多種重金屬的超富集植物，分別可累積30 000 mg/kg DW Zn[7]，14 000 mg/kg DW Cd[8]，4 700 mg/kg DW Ni[9]，因此被人們應(yīng)用于重金屬污染土壤的植物修復(fù)中；但因其生物量小，在土壤重金屬植物修復(fù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中具有一定缺陷，人們逐漸將它更多地作為一種模式植物，針對其特殊的重金屬耐性、超富集機(jī)理進(jìn)行廣泛深入地研究。迄今為止，遏藍(lán)菜重金屬超富集功能機(jī)制的研究主要在于，克隆和發(fā)現(xiàn)一些在植株體內(nèi)參與重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒相關(guān)一些基因和蛋白，通過的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步了解和發(fā)現(xiàn)這些蛋白和基因在重金屬富集以及運(yùn)輸過程中的作用。如Vert等發(fā)現(xiàn)TcIRT家族基因在植物Fe2+、Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮一定作用[10]。Hassinen轉(zhuǎn)基因擬南芥過量表達(dá)TcMT2、TcMT3基因后發(fā)現(xiàn)，這兩個基因的過量表達(dá)不會對植株Zn元素的富集產(chǎn)生直接影響[11]。Wei和Oomen等同時發(fā)現(xiàn)NRAMP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在遏藍(lán)菜對Ni2+、Fe2+金屬轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用[12-13]。除此之外，TcHMA、TcYSL等轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白編碼基因的發(fā)現(xiàn)以及功能鑒定進(jìn)一步拓寬了人們對遏藍(lán)菜重金屬超富集與耐受機(jī)制的認(rèn)識。本文主要綜述遏藍(lán)菜金屬螯合物和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能及其在重金屬耐性/超富集中的作用機(jī)制研究進(jìn)展。

1 重金屬離子螯合物

植物對重金屬的耐受與累積主要包括以下幾個生理學(xué)過程：首先，將根際周圍金屬離子活化，促進(jìn)根部的吸收，金屬離子進(jìn)入根部細(xì)胞后由各種螯合物進(jìn)行螯合解毒，同時在根部細(xì)胞中進(jìn)行區(qū)室化；其次，大部分的重金屬螯合復(fù)合物在木質(zhì)部裝載后通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸至地上組織，最終在葉部細(xì)胞液泡中進(jìn)行區(qū)室化存儲。在此過程中，金屬螯合物發(fā)揮了非常重要的作用：首先通過螯合作用對進(jìn)入體內(nèi)的重金屬進(jìn)行解毒，并隨后以金屬-螯合物復(fù)合體形式將重金屬離子通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等途徑從根部長距離運(yùn)輸至地上部分，隨后將金屬存儲于葉片中。至今已知的植物體內(nèi)的金屬螯合劑包括有機(jī)酸、氨基酸、金屬硫蛋白(Metallothionein)、尼克煙酰胺(Nicotianamine) 和植物絡(luò)合素(Phytochelatins) 等。

1.1 金屬硫蛋白 (MT)

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT) 是一種金屬結(jié)合蛋白，最初在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，通過研究發(fā)現(xiàn)它在植物重金屬螯合解毒方面也發(fā)揮重要作用。最初遏藍(lán)菜體內(nèi)關(guān)于重金屬螯合物相關(guān)分子生物學(xué)的研究便是起于對MT基因家族的研究。MT家族基因數(shù)量較多，約占植物總轉(zhuǎn)錄本的 3%[14]，在遏藍(lán)菜的700多個EST序列中，分別有MT基因家族同源基因Ⅰ型10個，Ⅱ型2個。TcMT3是遏藍(lán)菜中最早被發(fā)現(xiàn)的 MT家族基因。雖然它是一個組成型表達(dá)基因，但在受到Cd脅迫誘導(dǎo)后能在根部特異增量表達(dá)，因此推測它可能也具有根部重金屬特異誘導(dǎo)表達(dá)的特性。通過酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TcMT3轉(zhuǎn)化子對各種重金屬處理的反應(yīng)有明顯差異，對Cu和Cd處理的耐性增加，且前者優(yōu)于后者，而對Zn的耐性卻沒有明顯增強(qiáng)。以Cu敏感型酵母為轉(zhuǎn)化受體，比較AtMT3與TcMT3基因的功能差異，發(fā)現(xiàn)TcMT3轉(zhuǎn)化子對Cu的耐性好于AtMT3[15]。Roosens等對TcMT1和TcMT2也進(jìn)行了比較研究，序列比對結(jié)果顯示TcMT1與擬南芥AtMT1相比缺少了N-端的部分序列，同時與同家族其他MT1基因相比則缺失了多個保守的半胱氨酸殘基；另外，重金屬耐性試驗(yàn)結(jié)果表明，由于半胱氨酸殘基的缺失造成了MT蛋白與Cd2+結(jié)合能力的下降，細(xì)胞內(nèi)游離Cd2+濃度的增加造成細(xì)胞內(nèi)的毒性增大，從而產(chǎn)生細(xì)胞的耐性降低的現(xiàn)象。在與AtMT1、AtMT2進(jìn)行功能比較研究時發(fā)現(xiàn)，遏藍(lán)菜MT基因的轉(zhuǎn)錄活性優(yōu)于擬南芥AtMT1、AtMT2；但4個MT基因酵母轉(zhuǎn)化子的Cu、Cd、Zn耐性均顯著提高，其中AtMT2對Cd、Zn的耐性分別優(yōu)于TcMT2和AtMT1轉(zhuǎn)化子[16]。Hassinen等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過量表達(dá)TcMT2、TcMT3基因?qū)D(zhuǎn)基因植物Cu、Cd、Zn的耐性以及 Zn、Cd的富集能力均無明顯作用；因此推測MT蛋白過量表達(dá)后可能會影響植物在正常生理?xiàng)l件下對大量金屬元素的正常利用而造成特殊的現(xiàn)象：在對照情況下，與野生型比較，轉(zhuǎn)基因植株的根生長量降低；而在高濃度重金屬處理下，其根生長量卻沒有發(fā)生降低。但是研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度 Zn、Cd存在條件下，提高M(jìn)T基因的表達(dá)能夠維持植物體內(nèi)Cu2+的穩(wěn)態(tài)[11]。

1.2 尼克煙酰胺 (NA)

尼克煙酰胺(Nicotianamine，NA) 作為非蛋白型氨基酸，最初發(fā)現(xiàn)時認(rèn)為可能與植物體內(nèi)微量營養(yǎng)元素、重金屬元素的運(yùn)動相關(guān)[17]。NA合成酶 (NAS)最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)，是NA合成途徑中的關(guān)鍵酶。TcNAS1基因以單拷貝形式存在于遏藍(lán)菜基因組中。經(jīng)過 Ni處理 6 h后，只在遏藍(lán)菜地上部分檢測到TcNAS1表達(dá)，有趣的是根部卻存在高濃度的NA，而在莖的木質(zhì)部傷流中發(fā)現(xiàn)了NA-Ni的復(fù)合物；同時，TcNAS1轉(zhuǎn)基因植株 Ni耐性以及地上部分 Ni富集量均明顯提高。通過以上結(jié)果可以作出以下推測，植株在受到Ni處理后，首先TcNAS1在地上部分被誘導(dǎo)表達(dá)，并合成大量NA，然后NA被運(yùn)輸至根部與 Ni螯合，隨后以 NA-Ni復(fù)合物形式通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在木質(zhì)部導(dǎo)管等運(yùn)輸管道中向上運(yùn)輸至地上部分并儲存，而NA和NA-Ni在體內(nèi)的長距離運(yùn)輸過程中可能有一種特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與[18]。

1.3 植物絡(luò)合素 (PCs)

植物絡(luò)合素 (Phytochelatins，PCs) 是由 PC合酶合成的一種能與多種金屬元素如 Cd、Zn、Cu、Pb或者金屬性元素 As結(jié)合的多肽，多個研究成果證明它在多種重金屬超富集植物的重金屬耐受和富集過程中發(fā)揮重要作用。起初研究人員認(rèn)為，PCs在遏藍(lán)菜重金屬累積中的作用應(yīng)與其他重金屬富集植物類似；但是隨后研究發(fā)現(xiàn)可能存在一定差異。有研究發(fā)現(xiàn)，在Cd處理?xiàng)l件下，兩種不同金屬累積能力遏藍(lán)菜，根部以及葉片中的PCs含量無顯著差異[19]。這一結(jié)果表明，遏藍(lán)菜體內(nèi)的 PC含量不受重金屬誘導(dǎo)變化。已有研究證明PC合成途徑中的關(guān)鍵酶γ-EC抑制后，可抑制PC的生物合成。為了探究PCs在遏藍(lán)菜中的作用，Pence等將遏藍(lán)菜Prayon(非超富集) 與 Gange (超富集) 中的γ-EC合成酶進(jìn)行抑制，對兩種生態(tài)型在重金屬脅迫下的特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Prayon 的Cd敏感性增加，而Gange對Cd的耐性未發(fā)生變化。從此結(jié)果可以得出，PC可能在 Prayon受到 Cd脅迫初期發(fā)揮解毒作用，而Gange生態(tài)型可能是因?yàn)榫哂刑厥獾闹亟饘俑患约澳褪軝C(jī)制而表現(xiàn)出在PC含量很低的情況下對Cd仍有較強(qiáng)的耐受能力；也有人提出Gange也可能存在一種不同于PC的低分子量硫醇作為Cd的螯合劑在耐受過程中發(fā)揮作用[20]。

2 重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅在重金屬體內(nèi)運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要的作用，而且可轉(zhuǎn)運(yùn)微量元素和重金屬同時也參與植物體內(nèi)金屬穩(wěn)態(tài)的調(diào)控。已知金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族有ZNT/ZTP (Znic transproter)、MTP (Metal regulated protein)、HMA (P-type ATPases)、YSL (Yellow strip like)，Nramp (Natural resistance and macrophageprotein) 和IRT (Iorn regulated transporter) 等，少數(shù)基因已經(jīng)在擬南芥中進(jìn)行了功能鑒定。

2.1 ZNT/ ZTP (Zn transporter) 家族

TcZNT1是一個ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因，最初由Pence等在遏藍(lán)菜體內(nèi)發(fā)現(xiàn)；該基因定位在質(zhì)膜上，所表達(dá)蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞對 Zn、Cd的吸收。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，TcZNT1與酵母ZRT1和擬南芥AtZIP4基因具有很高的同源性；有趣的是，雖然TcZNT1基因與AtZIP4基因在核苷酸和氨基酸序列的同源性很高，分別為90%和81%，但是發(fā)現(xiàn)2個基因的功能有明顯差異[20]。Grotz等對TcZNT1進(jìn)行的酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)TcZNT1是一種Zn高親和型、Cd低親和型吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；TcZNT1在缺陷型酵母 (zrt1/zrt2mutant) 中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因酵母在低濃度Zn條件下不能夠生長，說明該基因所編碼蛋白是吸收型Zn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而AtZIP4基因表達(dá)后雖然也不能互補(bǔ)zrt1/zrt2的缺陷特性，但是它具有互補(bǔ)ctr1Cu缺陷型酵母的功能[21]。細(xì)胞定位表達(dá)分析結(jié)果同樣也證明這兩個基因在功能上有差異。AtZIP4基因定位在轉(zhuǎn)基因擬南芥中柱中，推測該基因的功能主要是在根部對從土壤中吸收的金屬離子進(jìn)行運(yùn)輸[22]。Kupper等利用定量原位雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TcZNT1基因在葉片的葉肉細(xì)胞、維管束鞘和保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，而不在葉片的表皮細(xì)胞，進(jìn)一步說明了在遏藍(lán)菜體內(nèi)TcZNT1只在維持植物對Zn的正常營養(yǎng)過程中發(fā)揮作用，可能并不參與金屬富集運(yùn)輸過程[23]。

2.2 MTP (Metal regulated protein) 家族

MTP是從Ni超富集植物Thlaspi goesenginse中克隆的一個CDF家族陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因。該基因與擬南芥的ZAT1基因同源，是遏藍(lán)菜中克隆獲得的第2類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。MTP1與ZTP1在氨基酸序列上的相似性很高；但是，TgMTP1定位在質(zhì)膜上，而TcZTP1定位于液泡；TgMTP1功能與AtZAT1相同主要是將各部位多余的 Zn運(yùn)至液泡[24-26]。Persans等發(fā)現(xiàn)，TcMTP1基因在遏藍(lán)菜基因組中以單拷貝形式存在，卻以TgMTP1t1和TgMTP1t2兩個轉(zhuǎn)錄本高效表達(dá)發(fā)揮作用。TgMTP1t1與Cd、Co、Zn的耐受相關(guān)，而TgMTP1t2只與 Ni耐受有關(guān)[27]。

2.3 HMA (P-type ATPases) 家族

HMA是一種 P-型ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因。主要是重金屬離子進(jìn)行長距離運(yùn)輸前，在木質(zhì)部裝載時發(fā)揮作用，依靠 P-型 ATP酶的活性與金屬離子大量結(jié)合裝載，然后向地上部分進(jìn)行運(yùn)輸，該類家族可以通過水解 ATP使物質(zhì)通過細(xì)胞膜運(yùn)輸。至今在遏藍(lán)菜中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個該家族成員。TcHMA4基因是通過酵母功能互補(bǔ)技術(shù)從遏藍(lán)菜文庫中篩選出來[28-29]，它屬于 P-型 ATPase超級家族中的P1B亞家族。兩個研究小組分別對TcHMA基因全長以及C端部分序列進(jìn)行酵母功能分析，發(fā)現(xiàn)在重金屬脅迫下該基因全長序列與C端部分序列的功能差異不明顯，氨基酸序列分析顯示C端含有組氨酸以及半胱氨酸序列，而這些序列主要負(fù)責(zé)結(jié)合Cd2+，因此C端序列在該蛋白與Cd2+結(jié)合過程中發(fā)揮主要作用；同時TcHMA4基因僅對 Cd累積以及運(yùn)輸方面發(fā)揮作用，對于其他金屬如Zn、Co、Pb、Ni則不具有以上功能。在具有不同金屬富集能力的3種遏藍(lán)菜生態(tài)型中均能檢測到TcHMA4基因表達(dá)，雖然 3種生態(tài)型在重金屬耐性以及富集能力上差異較大，但TcHMA4基因在3種生態(tài)型中表達(dá)量沒有明顯差異，并且該基因均在各自植物體內(nèi)重金屬運(yùn)輸富集過程中發(fā)揮重要作用[28]。Papoyan等發(fā)現(xiàn)，TcHMA4能夠降低轉(zhuǎn)基因植物對Cu、Pb、Zn的累積；TcHMA4基因在受到重金屬脅迫后主要在根部被誘導(dǎo)表達(dá)，因此推測TcHMA4可能主要通過調(diào)節(jié)金屬和其他微量元素從根部木質(zhì)部薄壁細(xì)胞外排至木質(zhì)部導(dǎo)管來發(fā)揮重金屬超富集作用，而不直接參與重金屬耐受過程[29]。

2.4 YSL (Yellow strip like) 家族

YSL(Yellow strip like) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因，最早發(fā)現(xiàn)于玉米根部，前期研究認(rèn)為YSL是植物體內(nèi)的一種 Fe2+運(yùn)輸載體；隨著家族其他成員被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，以及部分功能研究結(jié)果出現(xiàn)后，人們逐漸認(rèn)為該基因家族可能與 NA-金屬復(fù)合物的運(yùn)輸相關(guān)[30]。目前發(fā)現(xiàn)遏藍(lán)菜中有已發(fā)現(xiàn)3個YSL轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，根據(jù)與擬南芥YSL基因的序列同源性比較，分別命名為TcYSL3、TcYSL5和TcYSL7[31]。這3個基因在遏藍(lán)菜體內(nèi)的表達(dá)量均高于同源基因在擬南芥中表達(dá)水平；其中，TcYSL3和TcYSL7通常是主要在根部中柱中表達(dá)，可能與木質(zhì)部運(yùn)輸相關(guān)；而酵母功能分析結(jié)果發(fā)現(xiàn) TcYSL3具有將 Ni-NA和Fe-NA復(fù)合物運(yùn)輸進(jìn)入酵母的能力，基于以上的研究結(jié)果，由此作者認(rèn)為TcYSL3可能參與了遏藍(lán)菜的Ni轉(zhuǎn)運(yùn)的長距離運(yùn)輸[31]。

2.5 NRAMP (Natural resistance associated macrophage protein) 家族

NRAMP (Natural resistance associated macrophage protein)，由于此家族第一個成員發(fā)現(xiàn)時造成巨噬細(xì)胞特異蛋白變異，從而增加了對細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌病原菌的敏感性而得名[32]。經(jīng)過后續(xù)的研究，人們發(fā)現(xiàn)該家族基因在生物體內(nèi)的金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮作用。近幾年，NRAMP作為一種Fe相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被廣泛研究。本實(shí)驗(yàn)室前期從遏藍(lán)菜cDNA文庫中獲得一個NRAMP家族基因[33]，Wei等通過序列分析發(fā)現(xiàn)該基因包含11個跨膜域，并含有保守序列 (GQSSTITGTYAGQFIMGGFLN)，通過與其他物種該家族基因的進(jìn)化分析比較發(fā)現(xiàn)，該基因與擬南芥AtNRAMP3進(jìn)化距離最近，因此將該基因命名為TcNRAMP3。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TcNRAMP3轉(zhuǎn)化子在10 μmol/L Cd處理?xiàng)l件下生長受抑制，而在800 μmol/L Cd條件下則正常生長，并且好于對照。而重金屬累積能力分析發(fā)現(xiàn)，對照空載體所累積的Ni含量是TcNRAMP3轉(zhuǎn)化子的8.5倍，在Cd處理下的TcNRAMP3/4轉(zhuǎn)化子生長受到抑制。以上的結(jié)果初步表明TcNRAMP3/4可將Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)至酵母細(xì)胞內(nèi)，對Ni則相反，TcNRAMP3能將Ni外排至酵母細(xì)胞外而提高轉(zhuǎn)化子耐性 (圖1A)。轉(zhuǎn)基因煙草亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)TcNRAMP3/4基因均定位在質(zhì)膜上(圖 1B)，煙草根伸長分析結(jié)果顯示，TcNRAMP3過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草在Cd、Ni處理下，均與對照無顯著差異。推測可能是由于植物體內(nèi)其他二價陽離子參與了競爭，導(dǎo)致TcNRAMP3不能對Ni進(jìn)行有效運(yùn)輸[12]。Oomen等對TcNRAMP3和TcNRAMP4基因進(jìn)行了研究，通過表達(dá)分析、激光共聚焦照相和酵母及擬南芥轉(zhuǎn)化功能分析發(fā)現(xiàn)，TcNRAMP3和TcNRAMP4的表達(dá)量高于擬南芥中同源基因表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因酵母功能與擬南芥同源基因酵母轉(zhuǎn)化子的功能相似。NRAMP3能轉(zhuǎn)運(yùn) Fe、Mn、Cd，不能轉(zhuǎn)運(yùn)Zn，NRAMP4則能運(yùn)輸4種金屬。另外，熒光共聚焦分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因均定位在液泡膜上；TcNRAMP3和TcNRAMP4基因在擬南芥Atnramp3和Atnramp4基因突變體中過表達(dá)后，TcNRAMP3/4基因的表達(dá)能互補(bǔ)對AtNRAMP3/4基因缺陷造成對Zn、Cd處理的超敏反應(yīng)這一功能缺陷，使轉(zhuǎn)基因表型植株與野生型相當(dāng)。以上研究結(jié)果表明，TcNRAMP3/4與擬南芥中的同源基因可能只是在表達(dá)水平或者表達(dá)模式上有一定的差異，而在蛋白功能上沒有區(qū)別[13]。

圖1 TcNRAMP3/4酵母功能分析 (A) 和轉(zhuǎn)基因煙草根部TcNRAMP3/4亞細(xì)胞定位分析 (B)[12]Fig.1 Fuctional analysis of TcNRAMP3/4 in yeast under Cd Zn Ni (A) and subcellular localization of TcNRAMP3/4 in root of transgenic tobacco (B).

2.6 IRT (Iorn regulated transporter) 家族

IRT是一種 Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，同時也是一種 Cd2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[34]。IRT過表達(dá)后能夠造成植物的缺鐵反應(yīng)[35]。Lombi發(fā)現(xiàn) Gange和 Prayon生態(tài)型在缺鐵條件下都能增加對Cd的累積，且前者對Cd的累積能力遠(yuǎn)大于后者，而造成這一現(xiàn)象的原因正是TcIRT1基因[36]；兩種生態(tài)型 Gange和 Prayon都含有IRT1基因，但后者所含IRT1基因與前者相比在基因組序列中缺失了部分序列。但是這兩種IRT1基因?qū)τ贑d的運(yùn)輸能力都不及AtIRT1基因。Plaza 等通過對兩種遏藍(lán)菜生態(tài)型根部 Cd吸收進(jìn)行比較分析后認(rèn)為，TcIRT不是一種存在于根部的高親和能力的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[37]。

3 展望

遏藍(lán)菜有多種生態(tài)型分布在世界各地，生態(tài)型之間的重金屬富集與耐受能力有很大差異，對遏藍(lán)菜不同生態(tài)型的重金屬耐性以及運(yùn)輸比較研究也對了解金屬在植物體內(nèi)運(yùn)輸模式有很大幫助。前期的相關(guān)研究已經(jīng)建立了以遏藍(lán)菜為對象的多種研究、轉(zhuǎn)化體系，如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系[38]、懸浮細(xì)胞體系[39]等。這些成果不僅為進(jìn)一步研究遏藍(lán)菜植株體內(nèi)重金屬相關(guān)基因的功能提供了技術(shù)支持，也為改善遏藍(lán)菜植株的修復(fù)特性手段提供了新的支撐點(diǎn)。

遏藍(lán)菜是一種不可多得的重金屬超富集研究的模式植物，對它的研究不僅有助于了解植物重金屬超累積機(jī)理，同時幫助了解金屬微量元素的穩(wěn)態(tài)在植物金屬毒害或者營養(yǎng)中的功能。前期的研究結(jié)果已經(jīng)揭示了遏藍(lán)菜重金屬超富集部分機(jī)制，如人們認(rèn)為遏藍(lán)菜進(jìn)行富集主要通過刺激酸化根際的金屬離子通過根部細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入植物體，利用根部細(xì)胞的液泡對金屬進(jìn)行區(qū)室化，并且增加金屬在木質(zhì)部的裝載并向上運(yùn)輸至地上部分，從而刺激金屬進(jìn)入葉片細(xì)胞質(zhì)膜最終在液泡中進(jìn)行區(qū)室化 (圖 2)。

重金屬在植物體內(nèi)的螯合和轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)是超富集植物區(qū)別于其他普通植物的主要原因。多種螯合劑如植物絡(luò)合素、尼克煙酰胺和金屬硫蛋白，已經(jīng)證明在遏藍(lán)菜體內(nèi)與重金屬螯合并協(xié)助重金屬在植物體內(nèi)運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用，同時研究者認(rèn)為在遏藍(lán)菜體內(nèi)可能存在著一種未被檢測的低分子量物質(zhì)，參與了重金屬的螯合并作為載體參與從地下向地上部分的長距離運(yùn)輸。

圖2 遏藍(lán)菜重金屬富集與耐受分子機(jī)制Fig.2 Mechanism of heavy metal accumulation and tolerance ofThlaspi caerulescens.

多種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了金屬進(jìn)入細(xì)胞或者液泡膜的過程，有些則可攜帶金屬通過木質(zhì)部組織轉(zhuǎn)運(yùn)至葉片。雖然已有研究結(jié)果能夠在一定程度上闡明遏藍(lán)菜重金屬富集的機(jī)理，但是作為重金屬吸收螯合以及轉(zhuǎn)運(yùn)這一整套生理機(jī)制，需要整體的協(xié)同考慮。所以，遏藍(lán)菜作為重金屬超富集模式植物，還需要在前面的各項(xiàng)研究工作基礎(chǔ)上深入研究。作為相關(guān)研究工作者可以從以下兩點(diǎn)入手：首先，區(qū)分遏藍(lán)菜體內(nèi)的金屬螯合與其他植物的差異，探索遏藍(lán)菜是否有自己獨(dú)特的金屬螯合機(jī)制；另外，重金屬在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移、運(yùn)輸是植物耐受和超富集的關(guān)鍵，遏藍(lán)菜體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與所富集金屬運(yùn)輸之間默契的協(xié)同作用也值得今后更深入研究。

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Heavy metal absorption, transportation and accumulation mechanisms in hyperaccumulatorThlaspi caerulescens

Geyu Liu, Tuanyao Chai, and Tao Sun

College of Life Science,Graduate Universityof Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China

Received:November 17, 2009;Accepted:March 8, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA10Z407), Genetically Modified Organisms Breeding Major Projects (No. 2009ZX08009-130B).

Corresponding author:Tuanyao Chai. Tel/Fax: +86-10-88256343; E-mail: tychai@gucas.ac.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2006AA10Z407)，轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng) (No. 2009ZX08009-130B) 資助。