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        高溫油藏采出液中嗜熱產(chǎn)甲烷古菌的分離鑒定

        2010-10-11 02:11:26劉海昌蘭貴紅劉全全張文靜曹毅鄧宇張輝
        生物工程學報 2010年7期
        關鍵詞:生長實驗

        劉海昌,蘭貴紅,劉全全,張文靜,曹毅,鄧宇,張輝

        1 農(nóng)業(yè)部能源微生物與利用重點開放實驗室,成都 610041

        2 四川大學生命科學學院,成都 610065

        研究報告

        高溫油藏采出液中嗜熱產(chǎn)甲烷古菌的分離鑒定

        劉海昌1,蘭貴紅2,劉全全1,張文靜1,曹毅2,鄧宇1,張輝1

        1 農(nóng)業(yè)部能源微生物與利用重點開放實驗室,成都 610041

        2 四川大學生命科學學院,成都 610065

        為了進一步從高溫油藏中發(fā)掘新的微生物種質(zhì)資源,采用 Hungate 厭氧操作技術從大港油田油井采出水中分離出一株嗜熱自養(yǎng)產(chǎn)甲烷桿菌DL-7。生理生化結果顯示菌株DL-7只能夠利用H2/CO2生長,不利用甲酸、甲醇、三甲胺、乙酸和二級醇類;最適生長溫度60℃;最適鹽濃度0.8 g/L;最適pH為7.0~7.5;只有在添加酵母粉的培養(yǎng)基中才可以較好生長。16S rRNA序列比對結果顯示菌株DL-7與標準株M. marburgensisDSM 2133T (X15364) 的16S rRNA基因序列相似性為99.7%。

        油藏微生物,熱自養(yǎng)產(chǎn)甲烷桿菌,系統(tǒng)發(fā)育分析

        Abstract:To explore new microbial resources in deep subsurface oil reservoirs, strain DL-7 was isolated with Hungate technology from oil reservoir water sampled from Dagang oilfield, China. Physiological and biochemical examinations showed that H2/CO2is the unique substrate of the strain, which cannot metabolize formate, methanol, trimethylamine, acetate and other secondary alcohols. The optimum growth conditions were further identified to be 60°C, pH 7.0?7.5 and 0.25% NaCl. Moreover, the strain cannot grow without yeast extract. Analysis of its 16S rRNA sequence indicated that a similarity of 99.7% presents between the strain and the model speciesM. marburgensisDSM2133T (X15364).

        Keywords:microorganisms in petroleum reservoir, thermautotrophic methanogen, phylogenetic analysis

        已有的地球化學證據(jù)表明,產(chǎn)甲烷古菌進化史可以追溯到35億年前,幾乎等同于地球生命的進化史。盡管產(chǎn)甲烷古菌是地球上最古老的物種之一,但它們卻廣泛分布于各種環(huán)境中[1]。地下油藏是一個特殊的生境,生物地球化學研究結果證實,產(chǎn)甲烷條件下的烴降解是地下油藏中烴類物質(zhì)的主要代謝途徑[2];分子生態(tài)研究也表明,在缺氧、高溫、高礦化度和營養(yǎng)匱乏的油藏中分布著種類豐富的產(chǎn)甲烷古菌。近年來,我們從高溫油藏中分離到多株嗜熱產(chǎn)甲烷古菌,其中包括產(chǎn)甲烷古菌新科1個 (甲熱球菌科 Methermicoccaceae[3]) 和新種 1個 (石油甲烷袋狀菌Methanoculleus receptaculi)[4]。目前分離到的產(chǎn)甲烷古菌分布于3個綱、6個目、15科、33屬共計155個種。從1972年[5]第一株熱自養(yǎng)產(chǎn)甲烷桿菌的分離到現(xiàn)在,研究人員已經(jīng)從多種生境中分離到了數(shù)十株熱自養(yǎng)產(chǎn)甲烷桿菌,它們被劃分成6個種[6]。嗜熱產(chǎn)甲烷桿菌屬Methanothemobacter是高溫油藏中較為普遍的一類產(chǎn)甲烷古菌,同時這類產(chǎn)甲烷古菌也廣泛分布于高溫人工厭氧反應器的活性污泥中。菌株 DL-7分離于大港油田油藏采出水,它與嗜熱產(chǎn)甲烷桿菌屬中菌株M. marburgensisDSM2133T(X15364) 的16S rRNA基因序列相似性為99.7%,它只能利用H2/CO2生長,代時較長,約為6 h,生長溫度為47℃~68℃。

        1 材料與方法

        1.1 樣品

        樣品取自大港油田莊海8背斜區(qū)塊3號采油井,該油井為非注水井,井頂深為3 364.59 m,井底深為4 098.41 m,油層有效厚度為733 m。原油密度為0.9543 g/mL(20℃下測得),粘度為 599.0 mPa·s (50℃下測得)。油藏溫度65℃~75℃。

        1.2 富集、分離和純化

        1.2.1培養(yǎng)基

        采用亨蓋特厭氧操作改良技術[7]分離純化。富集培養(yǎng)[8]采用 MB培養(yǎng)基,分離培養(yǎng)基采用Medi2um141 (DSMZ),純化培養(yǎng)基采用Medium 119(DSMZ)。

        1.2.2操作方法

        采用亨蓋特厭氧操作改良技術進行液體梯度稀釋和固體滾管分離純化。25 mL厭氧管或120 mL血清瓶中加入無氧培養(yǎng)基,頂空為氮氣,121℃高壓滅菌30 min,接種后充入H2+CO2(V/V=4∶1,最終壓力約200 kPa) 混合氣,60℃培養(yǎng)。

        1.3 形態(tài)觀察

        采用熒光相差顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài),電鏡照片的制作參見文獻[9]。

        1.4 生理生化鑒定

        檢測:使用Nikon Eclipse 80i相差顯微鏡觀察,用Nikon DXM-1200C相機拍照:甲烷含量的測定采用島津GC-2010氣相色譜儀;電鏡照片采用AMRAY掃描電鏡觀察拍照[9]。

        1.4.1生理實驗

        生長條件測定包括最適pH值、最適生長溫度和最適NaCl濃度試驗。

        1.4.2生化實驗

        底物實驗、刺激因子實驗、抗生素敏感性實驗均采用改良的Medium141無機鹽培養(yǎng)基。

        不同底物 (終濃度) 利用實驗:H2/CO2(V/V=20 mL/5 mL)、甲酸鹽 (50 mmol/L)、甲醇(50 mmol/L)、甲胺 (50 mmol/L)、三甲胺(50 mmol/L)、乙酸鹽 (50 mmol/L)、乙醇(50 mmol/L)分別作為唯一碳源。

        不同刺激因子 (終濃度) 實驗:酵母粉0.2%、胰酶解酪蛋白0.2%、復合維生素溶液1%(V/V)、微量元素溶液 1%(V/V)、瘤胃浸提液 1%(V/V)、污泥浸提液 1%(V/V)、NaAC 50%、NiCl20.02%、Na2WO40.02%、Na2MoSO40.02%、HS-CoM 0.025%。

        不同抗生素抑制實驗:紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、利福平、氯霉素,終濃度均為200 μg/mL。

        1.5 16S rRNA序列擴增、測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

        1.5.116S rRNA基因擴增與測序

        提取基因組 DNA作為模板,用產(chǎn)甲烷菌 16S rRNA特異性引物進行 PCR擴增。正向引物Met-86F:5′-GCTCAGTAACACGTGG-3′,反向引物Met-1340R:5′-CGGTGTGTGCAAGGAG-3′。PCR反應條件:94℃預變性3 min;94℃變性30s,58℃退火 30s,72℃延伸 1.5 min,40 個循環(huán);72 ℃ 10 min 。1%瓊脂糖電泳,回收產(chǎn)物與載體pMD-18連接,轉化至E. coliJM109,送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

        1.5.2系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

        將菌株的 16S rRNA測序結果提交 GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行BLAST,使用Clustalx(1.83)軟件將與之同源性較高的產(chǎn)甲烷菌的16S rRNA序列進行比對,通過MEGA(4.1) 軟件采用鄰位相鄰法繪出系統(tǒng)發(fā)育樹并進行 Bootstape穩(wěn)定性檢驗(1 000 次)[10]。

        1.6 (G+C) mol%含量的測定

        根據(jù)熱變性溫度法[11](Tm值法) 測定基因組(G+C) mol%。測定菌株 DNA 的熱變性溫度 (Tm值),同時測定E. coliK12的Tm值。根據(jù)公式[11](G+C) mol%=51.2+2.08×[Tm(X)?Tm(K12)]計算出(G+C) mol%。

        2 結果與分析

        2.1 形態(tài)特征

        實驗表明,菌株DL-7革蘭氏染色呈陽性,菌體表面光滑無鞭毛,不運動,直徑 0.35~0.45 μm,長2.5 μm~5 μm,具有彎曲和直桿微彎2種形態(tài),單生、成對、多數(shù)成聚集狀態(tài)存在。60℃培養(yǎng)10 d長出菌落,菌落淡黃色、圓形、邊緣整齊。于紫外光(420 nm) 下產(chǎn)生綠色熒光,圖1為液體培養(yǎng)條件下處于對數(shù)生長期的熒光照片,圖 2液體培養(yǎng)基中菌體掃描電鏡照片。

        圖1 DL-7紫外熒光顯微照片 (100×)Fig.1 Fluorescence micrograph of strain DL-7 (100×).

        圖2 DL-7掃描電鏡照片F(xiàn)ig.2 Electron micrograph of strain DL-7.

        2.2 生理生化特征

        2.2.1生理特征

        菌株DL-7生長溫度范圍為47℃~68℃,最適溫度為 60℃(圖 3)。實驗發(fā)現(xiàn),菌株 DL-7生長 pH 6.0~8.5,最適pH為7.0~7.5 (圖4)。最適NaCl濃度為0.8 g/L (圖5)。表1是菌株DL-7與甲烷桿菌屬中幾株菌的主要性狀比較。由表1可見,DL-7菌株與其他幾株在最適生長溫度及分離源上有較大差別。

        圖3 溫度對菌株DL-7生長的影響Fig.3 Effect of temperate on the growth of strain DL-7.

        圖4 pH對菌株DL-7生長的影響Fig.4 Effect of pH on the growth of strain DL-7.

        2.2.2生化特征

        底物實驗結果表明,菌株DL-7只能利用H2/CO2為底物生長,不利用甲酸、甲醇、三甲胺、乙酸、乙醇等。

        抗生素實驗的結果表明,菌株DL-7對紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、利福平等抗生素均有抗性,對氯霉素敏感。

        表1 DL-7與幾株熱自養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌主要性狀的比較Table 1 Comparison between strain DL-7 and other most closely strains ofMethanothemobacter

        圖5 不同鹽濃度對菌株DL-7生長的影響Fig.5 Effect of salinities on the growth of strain DL-7.

        表1是DL-7菌株與幾株熱自養(yǎng)甲烷菌主要性狀的比較。由表1可見,DL-7菌株與其他幾株在最適生長溫度、最適pH值、分源等有明顯的不同。

        2.3 16S rRNA序列的測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建菌株

        菌株DL-7 的 16S rRNA 部分序列長 958 bp。根據(jù)菌株 DL-7 16S rRNA 測序結果進行 BLASTn分析,菌株 DL-7與M. marburgensisDSM 2133T(X15364) 的16S rRNA基因序列相似性為99.7%。菌株 DL-7 與嗜熱產(chǎn)甲烷桿菌屬其他菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析結果見圖6。

        圖6 基于16S rRNA序列相似性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences.

        3 討論

        雖然DL-7的16S rRNA與M. marburgensisDSM 2133T的相似性高達99.7%,但是二者在部分生理生化特征和G+C含量2個指標上還是有較大差異。其確切分類地位還有待用 DNA分子雜交[12]的技術手段作進一步的鑒定。

        高溫油藏環(huán)境經(jīng)歷了漫長的地質(zhì)年代的演化過程,作為一個典型的高溫高壓高礦化度的極端厭氧環(huán)境,其內(nèi)部的微生物菌群結構和物質(zhì)能量的代謝方式必然有其特殊性。產(chǎn)甲烷菌處于油藏厭氧環(huán)境中物質(zhì)代謝的最后控制環(huán)節(jié),它的生長特性必然影響著整個物質(zhì)傳遞鏈中各類菌群的代謝生長,同時產(chǎn)甲烷古菌的生長也必然受控于其上游整個菌群的生長代謝。因此,分離和研究高溫油藏中產(chǎn)甲烷古菌的代謝特征對我們認識油藏環(huán)境中整個物質(zhì)能量代謝特征有極其重要的意義。

        產(chǎn)甲烷古菌以其特殊的代謝方式參與地球生物圈中的碳素循環(huán),其代謝產(chǎn)物甲烷既是導致全球氣候變暖的第二大溫室氣體[13],同時又是最有前景的可再生新能源載體之一。探索研究產(chǎn)甲烷菌的進化歷史、分布范圍和代謝特征,已經(jīng)成為地球化學、環(huán)境化學、生物化學和微生物學等多學科交叉的研究熱點。

        高溫沼氣發(fā)酵工程作為人工控制的高溫厭氧產(chǎn)甲烷代謝體系,與高溫油藏厭氧發(fā)酵具有很多相似之處。在高溫沼氣發(fā)酵過程中,產(chǎn)甲烷菌群無疑是整個發(fā)酵代謝中最為重要的一環(huán),它們控制著整個代謝過程的速率。目前分離自高溫人工厭氧生物反應器的產(chǎn)甲烷古菌很大一部分屬于嗜熱產(chǎn)甲烷桿菌屬,通過對該類產(chǎn)甲烷菌群的研究有助于我們對整個高溫產(chǎn)甲烷發(fā)酵體系的認識,從而更好指導我們對高溫產(chǎn)甲烷發(fā)酵工程的設計、調(diào)試和運行。

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        Isolation and identification of a methanogen from the high temperature oil reservoir water

        Haichang Liu1, Guihong Lan2, Quanquan Liu1, Wenjing Zhang1, Yi Cao2, Yu Deng1,and Hui Zhang1

        1Key Laboratory of Energy Microbiology and Application,Chengdu610041,China
        2School of Life Science,Sichuan University,Chengdu610065,China

        Received:May 22, 2010;Accepted:July 6, 2010

        Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 40973059).

        Corresponding author:Hui Zhang. Tel/Fax: +86-28-85258573; E-mail: zhanghuits@yahoo.com.cn

        國家自然科學基金 (No. 40973059) 資助。

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