曹相玫,景 麗△,張建中,孫金萍,安 欣,郭鳳英

(寧夏醫(yī)科大學(xué):1.病理系;2.附屬醫(yī)院病理科 銀川750004)

高血壓細(xì)小動(dòng)脈重構(gòu)直接影響高血壓發(fā)生、發(fā)展,參與導(dǎo)致靶器官結(jié)構(gòu)和功能損害,研究同時(shí)表明,大動(dòng)脈重構(gòu)在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[1]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖/凋亡失衡是高血壓引起血管重構(gòu)的主要原因[2]。VSMC增殖/凋亡失衡的機(jī)制不清,胞漿型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2)活化后可對(duì)細(xì)胞的分化和增殖產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用,cPLA2的活化多經(jīng)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路(Ras/Raf/MEK/ERK)進(jìn)行[3-4],生理狀態(tài)下,ERK是M EK的惟一下游底物,MEK和ERK在該通路中具有重要地位。本研究探討高血壓主動(dòng)脈VSMC中cPLA2的作用以及與ERK 1/2上游激酶MEK的關(guān)系,以進(jìn)一步明確高血壓狀態(tài)下大動(dòng)脈VSMC增殖/凋亡失衡參與血管重構(gòu)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)15只,雄性Wistar大鼠(WKY)15只,均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。單克隆磷酸化兔抗 p-MEK1/2 IgG(Ser2211)抗體(Cell Signaling公司產(chǎn)品),單克隆磷酸化兔抗p-cPLA-2 IgG(P3639 Rb-h)抗體、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素法(streptavidin-biotin-peroxidate complex,SABC)免疫組化染色試劑盒(USCNLIFE公司產(chǎn)品),山羊抗兔IgG-HRP(克隆號(hào):04-15-06,KPL公司),PBS緩沖液、多聚賴氨酸、3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3-diaminobenzidine DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),預(yù)染Marker(蘭州TIANGEN公司),Western一抗稀釋液、RIPA細(xì)胞裂解液(武漢碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 將15只 SHR分為 4、16、24周齡組,15只WYK作為對(duì)照。SHR大鼠出廠時(shí)經(jīng)尾動(dòng)脈儀測(cè)量基礎(chǔ)血壓及心率;所有大鼠均飼養(yǎng)于SP-F級(jí)環(huán)境中,安靜、正常光照、正常飲食。每周同一時(shí)間用BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)測(cè)大鼠動(dòng)脈壓1次,至周齡處死。于處死前,經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后,經(jīng)股動(dòng)脈插管連接二導(dǎo)生理記錄儀測(cè)量動(dòng)物心率(HR)、動(dòng)脈收縮壓(SAP)、動(dòng)脈舒張壓(DAP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)等。迅速取出胸主動(dòng)脈一半置于DEPC處理后的4%中性多聚甲醛溶液(1∶1 000)中固定48 h,用于免疫組化檢測(cè);一半裝入凍存管,投入液氮中迅速冷凍后移置于-80℃冰箱中冷凍,用于Western blot測(cè)定蛋白含量。

1.2.2 免疫組化法 采用SP法。操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行,選擇推薦的乳腺癌標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照、PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,DAB顯色。

1.2.3 Western-blot檢測(cè) 按照蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳操作步驟進(jìn)行配膠、電泳、DAB染色及采集圖像。

1.2.4 結(jié)果判斷 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均取自胸主動(dòng)脈,以其冠狀切面包埋后切片,隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)高倍視野中的全部 VSMC細(xì)胞數(shù),p-cPLA2和p-MEK染色均以胞漿出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒視為陽(yáng)性細(xì)胞。Western blot檢測(cè)結(jié)果經(jīng)BIO-RAD生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)目的顯色條帶進(jìn)行光密度分析和掃描半定量分析。觀察各實(shí)驗(yàn)組泳道膜上棕黑色目的蛋白帶密度的灰度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),兩組間血壓用t檢驗(yàn),免疫組化陽(yáng)性率用χ2檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況 實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)期間飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量增長(zhǎng)均正常,無(wú)動(dòng)物死亡現(xiàn)象。圖1為各組大鼠處死時(shí)心臟/體質(zhì)量趨勢(shì)圖,WKY的體質(zhì)量均高于同周齡SHR。SHR的心臟/體質(zhì)量比值均較同周齡WKY的心臟/體質(zhì)量比值高,并且隨周齡增加心臟/體質(zhì)量比值呈增高趨勢(shì)。

2.2 血壓變化 實(shí)驗(yàn)期間,各周齡WKY M AP維持在(106.22±11.52)～(110.60±12.50)mm Hg之間。4周齡SHR血壓為(90.25±4.13)mm Hg,8周齡組開始升高,SHR8、SHR16、SHR24明顯高于 SHR4和同周齡 WKY,圖2為SHR血壓隨周齡的增加呈升高趨勢(shì)。

2.3 p-cPLA2檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 主動(dòng)脈VSMC中p-cPLA2免疫組化染色表明p-cPLA2在各組大鼠主動(dòng)脈VSMC中有不同程度的表達(dá),SHR和WKY均隨周齡增加其表達(dá)逐漸增強(qiáng),SHR表達(dá)率低于同周齡WKY(表1),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。SHR24陽(yáng)性細(xì)胞少,陽(yáng)性細(xì)胞著色淡,其分布多接近內(nèi)皮下和外膜下(圖3a),而WKY 24主動(dòng)脈各層VSMC均可見(jiàn)較廣泛的表達(dá)(圖3b)。

2.3.2 主動(dòng)脈VSMC中p-cPLA 2經(jīng)Western blot檢測(cè)未檢出,可能由于組織在-80℃冰箱放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng),同時(shí)裂解過(guò)程處理不當(dāng),而組織中p-cPLA2易失去活性,所以經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn),Western blot均未檢出。

2.4 p-MEK的檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 主動(dòng)脈VSMC中p-MEK免疫組化染色結(jié)果 SHR和WKY均隨周齡增加其p-MEK表達(dá)逐漸增強(qiáng),SHR表達(dá)于同周齡WKY(表2),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,SHR24主動(dòng)脈中各層VSMC均可見(jiàn)較廣泛的表達(dá)(圖4a),而WKY24表達(dá)明顯減少,且細(xì)胞著色淡,多分布于內(nèi)皮下和外膜下(圖4b)。

2.4.2 p-MEK Western blot檢測(cè)結(jié)果 相對(duì)分子質(zhì)量43 k D附近可見(jiàn)p-MEK蛋白雜交條帶(圖5),經(jīng)蛋白條帶相對(duì)濃度分析顯示,隨周齡增加SHR主動(dòng)脈VSMC中p-MEK蛋白相對(duì)含量逐漸增高。

表1 主動(dòng)脈VSMC中p-cPLA 2的表達(dá)[個(gè)/20HPF,(%)]

表2 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中p-MEK的表達(dá)[個(gè)/20HPF,(%)]

圖1 各組大鼠處死時(shí)心臟/體質(zhì)量變化趨勢(shì)圖

圖2 各組大鼠血壓變化趨勢(shì)圖

圖3 主動(dòng)脈VSMC中p-cPLA 2免疫組化染色(DAB顯色,×400)

圖4 主動(dòng)脈VSMC中p-MEK1/2免疫組化染色(DAB顯色,×400)

圖5 主動(dòng)脈VSMC中p-MEK1/2 Western blot檢測(cè)

3 討 論

高血壓時(shí)大動(dòng)脈重構(gòu)主要表現(xiàn)為管腔擴(kuò)張,管壁增厚、鈣化,病變血管壁中層彈性纖維數(shù)量減少、彈性膜斷裂,膠原纖維增殖、聚集,彈力纖維與膠原纖維的比例明顯下降;彈力膜內(nèi)的平滑肌細(xì)胞肥大、排列紊亂,纖維基質(zhì)與平滑肌細(xì)胞的結(jié)合松散,導(dǎo)致大動(dòng)脈順應(yīng)性減退[5]。

臨床上,高血壓患者主動(dòng)脈長(zhǎng)期受高血壓及高應(yīng)力的影響,順應(yīng)性下降,是造成心肌肥厚和心功能不全的重要因素[1]。在高血壓患者中,約有1/3會(huì)出現(xiàn)左室肥厚,這是心臟對(duì)慢性壓力和容積超負(fù)荷的適應(yīng)性變化,也是血管重構(gòu)引起心臟受累的病理表現(xiàn)。本研究證實(shí),SHR從8周齡開始血壓明顯升高,隨周齡增加,SHR血壓逐漸升高、心臟/體質(zhì)量比值也逐漸升高,可能提示高血壓狀態(tài)下主動(dòng)脈發(fā)生重構(gòu)、順應(yīng)性下降,使心臟長(zhǎng)期壓力負(fù)荷增加而造成代償性肥厚。

磷脂酶A2是一類能水解磷脂sn-22位酯鍵釋放出游離的脂肪酸和溶血磷脂的酯酶超家族[3],分為分泌型、胞漿型和鈣離子非依賴型三大類[12],在炎癥中發(fā)揮重要作用,其中cPLA2可通過(guò)磷酸化作用而活化,活化后與細(xì)胞的增殖和凋亡有密切的關(guān)系[4]。王韻等[7]進(jìn)行人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白的研究提示,cPLA2的活化參與了MM-LDL引起的AA釋放和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Panini[8]等研究發(fā)現(xiàn),cPLA2通過(guò)鈣調(diào)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與25-OHC或氧化修飾低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞凋亡。Faghini等[9]研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ通過(guò)活化cPLA2后激活VSMC中Syk(一種72 k D酪氨酸激酶,與生長(zhǎng)、分化以及造血和非造血細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)),促進(jìn)VSMC分化和增殖,并由 LO促進(jìn) AA產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各周齡SHR和WKY的主動(dòng)脈VSMC中p-cPLA2均有表達(dá),且隨著大鼠周齡增加,p-cPLA2表達(dá)率增加;各周齡SHR表達(dá)均比同周齡WKY明顯減少,可能提示隨著大鼠周齡增加,內(nèi)外環(huán)境的某些刺激因素可激活cPLA2,活化的cPLA2可以誘導(dǎo)大動(dòng)脈VSMC凋亡,而在高血壓狀態(tài)下,復(fù)雜的體內(nèi)外環(huán)境因素使cPLA2對(duì)大動(dòng)脈VSMC凋亡調(diào)節(jié)減弱,細(xì)胞增殖活性相對(duì)增強(qiáng),間質(zhì)膠原纖維增殖、聚集,使大動(dòng)脈重構(gòu)、彈性減退、順應(yīng)性下降,而促使SHR心臟肥大、心臟/體質(zhì)量比值增加。

cPLA2的磷酸化激活主要是通過(guò)兩條途徑,即MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和鈣/鈣調(diào)蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,多數(shù)細(xì)胞經(jīng)MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ERK通路活化cPLA2。其整個(gè)過(guò)程為:通過(guò) Ras→Raf→MEK1/2→ERK 1/2環(huán)節(jié)中的 Raf蛋白磷酸化cPLA2的兩個(gè) MAPKs磷酸化位點(diǎn)(S505和S727)而將其激活,激活cPLA2使其對(duì)細(xì)胞的分化和增殖產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[4,6]。Su等[10]研究顯示,衣原體吸收甘油磷酸變位酶必須Raf-MEK-ERK-cPLA2信號(hào)級(jí)聯(lián)的活化:Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2途徑和cPLA2可被衣原體感染活化;cPLA2抑制劑阻斷了衣原體攝取甘油磷酸變位酶并降低了衣原體的生長(zhǎng)活性;封閉c-Raf-1或MEK 1/2的活性可以阻止衣原體ERK1/2的激活,而阻止了衣原體對(duì)宿主細(xì)胞cPLA2的活化和甘油磷酸變位酶的釋放。Pavicevic等[11]對(duì)兔VSMC進(jìn)行在體研究顯示,cPLA2通過(guò)ERK 1/2途徑被絲氨酸-505(S505)磷酸化而激活。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各周齡SHR和WKY的主動(dòng)脈VSMC中p-MEK均有表達(dá),且隨著大鼠周齡增加,p-M EK陽(yáng)性表達(dá)增加;SHR比同周齡WKY表達(dá)均明顯增高。與之相反,SHR p-cPLA2表達(dá)與同周齡WKY相比均明顯減少。提示MEK的激活與cPLA2活性減弱可能共同參與了高血壓大動(dòng)脈血管重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展。

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