聶東宋,劉 宇, 馮驚濤,胡道奇

(1.湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 岳陽(yáng) 414006;2.湖南景達(dá)制藥有限公司,湖南 岳陽(yáng) 414001)

丙型肝炎病毒截短型核心C區(qū)和NS3區(qū)融合蛋白(C8-NS3)的原核表達(dá)

聶東宋1,劉 宇1, 馮驚濤2,胡道奇2

(1.湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 岳陽(yáng) 414006;2.湖南景達(dá)制藥有限公司,湖南 岳陽(yáng) 414001)

通過(guò)RT-PCR從HCV 全長(zhǎng)基因組中分別克隆HCV核心區(qū)和NS3非結(jié)構(gòu)區(qū)的部分優(yōu)勢(shì)表面抗原的基因片段,運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)將它們拼接成融合基因,將融合基因再克隆到表達(dá)載體pTrcHis2 TOPO TA中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,陽(yáng)性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)15% SDS- PAGE鑒定,重組蛋白經(jīng)His標(biāo)簽純化.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可高效表達(dá)分子量約為14.4KD的融合抗原,重組蛋白主要以可溶性形式存在.經(jīng)過(guò)純化目的蛋白純度達(dá)96.3% 以上的,表達(dá)量約為550μg/mL.ELISA結(jié)果表明純化蛋白具有良好的抗原性.

丙型肝炎病毒;蛋白表達(dá);抗原檢測(cè)

丙型肝炎病毒( hepatitis C virus,HCV)所致的丙型肝炎(HC)是一種危害嚴(yán)重的傳染病,HCV 主要通過(guò)輸血傳播,可以導(dǎo)致多種臨床型的肝炎及其他肝臟疾病,包括肝硬化及肝癌.全世界 HCV 感染人數(shù)達(dá) 1.7 億,我國(guó)HCV感染者已超過(guò) 4000 萬(wàn),因此,丙型肝炎已經(jīng)成為全球性嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題之一.

HCV 基因組為單股正鏈RNA,約9.5 kb,僅含一個(gè)開(kāi)放閱讀框,翻譯成一個(gè)約3 010～3 033 個(gè)氨基酸的聚蛋白前體,由宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶和病毒蛋白酶加工成多個(gè)成熟蛋白[1].人感染HCV后,抗HCV核心蛋白和抗NS3蛋白的抗體出現(xiàn)較早,持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),是HCV早期診斷的可靠依據(jù),對(duì)于縮短“窗口期”[2]、盡早檢測(cè)出HCV 感染以及監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)病毒載量、評(píng)價(jià)治療效果有著極其重要的意義.其中HCV核心蛋白是HCV 結(jié)構(gòu)基因core編碼的一種結(jié)構(gòu)蛋白,全長(zhǎng)191個(gè)氨基酸,其氨基酸序列十分保守.核心蛋白(C蛋白)抗體在人感染HCV后出現(xiàn)較早,抗原免疫原性最強(qiáng)且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),但由于核心蛋白為強(qiáng)堿性蛋白,且具細(xì)胞毒性,全長(zhǎng)core基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中很難穩(wěn)定表達(dá).HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3分子量為70kDa,有絲氨酸蛋白酶和ATP 酶及RNA 解旋酶活性,參與聚蛋白前體加工和RNA 復(fù)制過(guò)程[3～5].NS3蛋白也較早被用于HCV 的血清學(xué)檢測(cè),與其它HCV 結(jié)構(gòu)蛋白相比,NS3靈敏度最高,同時(shí)丙肝抗體動(dòng)態(tài)研究表明,NS3抗體也在HCV 感染早期出現(xiàn)[6,7].由此可知,核心蛋白抗原和NS3抗原在丙型肝炎的檢測(cè)中起很重要作用,提高檢測(cè)C蛋白和NS3抗體靈敏度在HCV 的早期檢測(cè)中有重要意義.

本研究首先通過(guò)重疊延伸PCR 技術(shù)(overlap extension PCR,OE PCR),把HCV核心區(qū)(HCV-core:8-36aa)和NS3非結(jié)構(gòu)區(qū)(NS3:1393-1457aa)的部分優(yōu)勢(shì)表面抗原基因串聯(lián),克隆HCV復(fù)合多表位融合基因,構(gòu)建入原核表達(dá)載體pTrcHis2 TOPO TA中,在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白并進(jìn)行純化,初步分析其抗原性和免疫原性,為HCV臨床檢測(cè)提供理想的診斷抗原奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

HCV抗原陽(yáng)性血清由湖南景達(dá)制藥有限公司中心實(shí)驗(yàn)室提供;pTrcHis2 TOPO TA Expression Kits 購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司;Advantage 2 PCR Kit購(gòu)自美國(guó)CLONETECH公司;pUC Mix Marker,8購(gòu)自立陶宛Fermentas公司;羊抗人IgG購(gòu)自Sigma公司;菌株BL21為湖南景達(dá)制藥有限公司中心實(shí)驗(yàn)室保存菌種.HCV 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海科華生物技術(shù)公司,HCV 抗原檢測(cè)試劑盒由湖南景達(dá)制藥有限公司提供,其余化學(xué)試劑為分析純.

1.2 方法

1.2.1 OE-PCR法拼接和擴(kuò)增HCV嵌合基因片段

采用BioSun3.0生物軟件分析HCV(GenBank accession NO:AB492206.1)氨基酸序列的抗原表位,選取HCV核心區(qū)和NS3非結(jié)構(gòu)區(qū)帶有優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域的兩段HCV多肽,找出對(duì)應(yīng)堿基序列,設(shè)計(jì)引物 4條,分別為:

引物由上海生工合成.然后用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法從HCV陽(yáng)性血清中擴(kuò)增出HCV-core、HCV-NS3兩段目的基因.將PCR產(chǎn)物用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化,然后取等量的各種DNA加入Advantage 2 PCR Kit的PCR反應(yīng)體系中,在不加任何其他引物的情況下反應(yīng)5～7個(gè)循環(huán)(98℃ 10s,68℃,1.2 min);然后向該P(yáng)CR體系中加入引物HCV-core-F和HCV-NS3-R,繼續(xù)反應(yīng)30個(gè)循環(huán),取產(chǎn)物5μL進(jìn)行1.7%瓊脂糖凝膠電泳.

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將拼接擴(kuò)增好的HCV嵌合基因按照pTrcHis2 TOPO TA Expression Kits說(shuō)明書克隆入pTrcHis2 TOPO TA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,進(jìn)行PCR篩選(上游引物由試劑盒提供,下游引物為HCV-NS3-R).陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序分析正確后,進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).

1.2.3 HCV嵌合抗原的誘導(dǎo)表達(dá)和抗原表達(dá)方式的確定

將篩選到的陽(yáng)性克隆菌株接種于LB培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素50 μg/mL),37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜.然后按照1:50的比例接種到1000 mL LB培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素50 μg/mL),37℃振蕩培養(yǎng)3～4h,直至A600值約為0.6時(shí),加入IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)4～6 h后,收集1 mL菌液,12000 r/min離心2 min.沉淀重懸于400 μL的1×SDS上樣緩沖液中,沸水浴5 min,取20μL進(jìn)行15% SDS-PAGE膠電泳.

取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌1.5 mL,12000轉(zhuǎn)離心2 min,收集菌體重懸于300μL雙蒸水中,超聲破碎菌體細(xì)胞,12000轉(zhuǎn)離心10 min.上清用等體積的2×SDS上樣緩沖液處理,沉淀用300 μL 1×SDS上樣緩沖液重懸,沸水浴5 min,取20 μL進(jìn)行15% SDS-PAGE膠電泳.

1.2.4 HCV嵌合抗原的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間選擇和純化

HCV嵌合抗原的純化:將1000 mL 的表達(dá)菌,10000 r/min離心10 min收集菌體.將菌體懸浮于60 mL緩沖液bufferⅠ(20 mM Tris,500 mM NaCl,pH 7.9),冰浴情況下超聲破碎直至菌體清亮(約30 min),4℃,12000 r/min離心15 min,取上清,然后進(jìn)行His標(biāo)簽純化,最后用15% SDS-PAGE膠鑒定.

1.2.5 融合蛋白的抗原性的初步鑒定

把純化的HCV 融合抗原作適當(dāng)稀釋包被酶標(biāo)板,用牛血清白蛋白封閉,分別加入10 μL 人丙肝陽(yáng)性血清或陰性血清和90 μL PBS,37℃接觸反應(yīng)30 min,洗滌后再加入稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG反應(yīng)(40℃,20 min),用TMB顯色,測(cè)A450值.

2 結(jié)果

2.1 HCV嵌合基因的拼接和擴(kuò)增

重疊延伸突變PCR可以在DNA區(qū)段的任何位置突變,且可以在側(cè)引物的兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn),方便進(jìn)一步的連接克隆,目前該方法已經(jīng)廣泛用于基因突變體的構(gòu)建.我們采用該方法成功構(gòu)建HCV核心抗原和NS3嵌合體(C8-NS3)的構(gòu)建,如圖1所示,重疊延伸PCR拼接和擴(kuò)增的嵌合基因大小為 282 bp,符合HCV嵌合基因的預(yù)期結(jié)果.

圖1 OE-PCR拼接的嵌合基因C8-NS3

2.2 HCV嵌合抗原的誘導(dǎo)表達(dá)

原核表達(dá)載體pTrcHis2 TOPOTA是一種帶有T末端表達(dá)載體,可以將帶有A尾的PCR產(chǎn)物直接插入到載體中去,然后通過(guò) PCR篩選,方便快捷地構(gòu)建原核表達(dá)載體.pTrcHis2 TOPO TA在表達(dá)產(chǎn)物的末端帶有六個(gè)His氨基酸,使后續(xù)的蛋白純化大大簡(jiǎn)化,方便得到純度很高的重組蛋白產(chǎn)物.我們構(gòu)建的原核表達(dá)載體表達(dá)的 HCV嵌合抗原理論分子量大約為 14.4KD.據(jù)圖2所示,誘導(dǎo)表達(dá)后較誘導(dǎo)表達(dá)前在約14.4KD處有一明顯的蛋白成分,與預(yù)期分子量一致.表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性的形式存在(圖2,圖3).

圖2 大腸桿菌中嵌合基因表達(dá)產(chǎn)物的15% SDS-PAGE鑒定

圖3 大腸桿菌中嵌合基因表達(dá)位置的確定(15% SDS-PAGE)

2.3 HCV嵌合抗原的純化

1000 mL 表達(dá)菌,經(jīng)超聲波破菌后,收集菌體上清.將上清進(jìn)行His標(biāo)簽純化,最后用15% SDS-PAGE膠鑒定(圖4),結(jié)果表明在 14.4KD處為單一條帶,沒(méi)有其它條帶出現(xiàn),掃描結(jié)果表明純化后目的蛋白的純度約為96.3%.BCA試劑盒分析表明:蛋白表達(dá)量約為550 μg/mL.

圖4 純化HCV核心區(qū)融合蛋白的SDS-PAGE分析

2.4 抗原活性分析

用純化的目的蛋白包板,間接ELISA檢測(cè)HCV內(nèi)質(zhì)控陽(yáng)性血清, 結(jié)果(見(jiàn)表1)表明,在10份已知慢性HCV 患者血清中檢出陽(yáng)性10份,A值均數(shù)為2.003,陽(yáng)性率100%;而作為對(duì)照的5份HBsAg陽(yáng)性血清、5份正常人HCV陰性血清與嵌合蛋白進(jìn)行的ELISA結(jié)果均呈陰性反應(yīng),A值均數(shù)為0.068.說(shuō)明表達(dá)的嵌合抗原具有良好的免疫原性和特異性.

表1 純化嵌合蛋白的ELISA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前市售的 HCV ELISA檢測(cè)試劑盒所用抗原主要是基因表達(dá)和多肽合成,有單獨(dú)使用,也有混合使用,主要包括了核心區(qū)和NS3非結(jié)構(gòu)區(qū)等抗原.但由于抗原的選擇區(qū)域并不完全同于天然的抗原,有時(shí)會(huì)因比出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象,而影響檢測(cè)的靈敏度和特異性.HCV感染者血清中絕大部分都有核心區(qū)蛋白和NS3非結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白的抗體出現(xiàn)且持續(xù)存在,因此表達(dá)HCV核心區(qū)和NS3非結(jié)構(gòu)區(qū)的融合蛋白,可以有效避免HCV感染者的漏檢.以前報(bào)道嵌合基因的連接多是采用人工合成的短接頭,或在拼接基因相連引物中設(shè)計(jì)一個(gè)相同的酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接,該方法操作復(fù)雜,且要求連接的各種成分能夠形成各自正常的空間結(jié)構(gòu),以保持天然活性.因而連接肽的長(zhǎng)度、所選氨基酸的組分及其伸展性或活性基團(tuán)能否充分暴露等都是關(guān)鍵.我們采用重疊延伸PCR技術(shù)(OE-PCR)拼接嵌合基因,在連接肽中不必因限制性酶切位點(diǎn),而引入不必要的氨基酸殘基,快速構(gòu)建了含有核心和NS3片段的嵌合基因.由于此技術(shù)是利用PCR技術(shù)在體外進(jìn)行有效的基因重組,因此不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理,是一種高效快速獲得融合基因的好方法.通過(guò)BioSun3.0生物軟件分析HCV氨基酸序列的優(yōu)勢(shì)抗原表位,選取HCV-core(8-36aa)和HCV-NS3(1393-1457aa)兩段多肽進(jìn)行嵌合,與我們以前構(gòu)建的嵌合蛋白形成有效地補(bǔ)充.構(gòu)建了含有C 區(qū)和NS3區(qū)的表面優(yōu)勢(shì)抗原基因的融合表達(dá)質(zhì)粒pTrcHis-C8-NS3.在不降低其免疫活性的基礎(chǔ)上,盡量減少其蛋白分子量,可使得其在大腸桿菌中易于表達(dá),并增加蛋白穩(wěn)定性.

本研究采用的表達(dá)系統(tǒng)為pTrcHis2 TOPO TA Expression Kits,此系統(tǒng)為T載體表達(dá)系統(tǒng),可以方便地構(gòu)建表達(dá)載體.同時(shí),該載體所表達(dá)的融合蛋白帶有6個(gè)組氨酸尾巴,使得該融合蛋白的純化方便、易行,并能有效地得到純度很高的表達(dá)蛋白.

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Expression of Truncated HCV Core and NS3Antigen and Its Immunogenicity Assay

NIE Dong-song1,LIU Yu1,FENG Jing-tao2,HU Dao-qi2
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan Institute of Science and Technology,Yueyang 414006,China;2.Hunan Jingda Bioengineering Co.LTD,Yueyang 414001,China)

DNA fragments of HCV Core fragment and NS3fragment were obtained from HCV genome by RT-PCR,then all the fragments were linked by overlap extension PCR (OE-PCR)to form a chimeric gene C8-NS3.The chimeric gene was then ligated to expression vector pTrcHis2 TOPO TA and the recombinant protein was expressed in Escherichia coli and.Ni+affinity column was used to purify the recombinant proteins.The recombinant protein was correctly expressed;a band of 14.4 kD was detected by 15% SDS-PAGE and Western blot analysis.After purification to over 96.3%,its yield amounted to 550μg/mL.ELISA result shows that the purified protein has good antigenicity.

hepatitis C virus (HCV);protein expression;antigen analysis

Q786

A

1672-5298(2010)04-0042-04

2010-09-09

國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃(863)重點(diǎn)課題(2006AA020907);中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20070410996)

聶東宋(1967? ),男,湖南衡陽(yáng)人,湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院副教授.主要研究方向:新基因克隆及功能研究