馮雷，張學(xué)忠，牛之瑞，祝紅昆，李波

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明650223）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蜂蜜中氯霉素殘留

馮雷，張學(xué)忠，牛之瑞，祝紅昆，李波

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南昆明650223）

研究一種針對(duì)蜂蜜中氯霉素殘留量的液質(zhì)聯(lián)用分析方法。采用水溶解蜂蜜，用乙酸乙酯萃取蜂蜜水溶液中的氯霉素，氮吹至干后用水溶解樣品殘?jiān)缓笥肏LB小柱進(jìn)行固相萃取，對(duì)樣品中的氯霉素進(jìn)行凈化前處理。以乙腈-水作為流動(dòng)相，C18色譜柱對(duì)蜂蜜的氯霉素進(jìn)行分離，然后用電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式[ESI(-)-MRM]對(duì)氯霉素進(jìn)行檢測(cè)，縮短了色譜分離時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度和分析結(jié)果可靠性，具有準(zhǔn)確、快速以及高靈敏度和高選擇性的特點(diǎn)，能夠適應(yīng)大規(guī)模樣品的快速分析要求。

氯霉素；蜂蜜；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用；分析

氯霉素屬胺苯醇類廣譜抗生素，由Ehrlich等在1947年首次從微生物代謝產(chǎn)物中分離得到，目前用人工方法合成,已廣泛用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療[1]。氯霉素對(duì)人體有嚴(yán)重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[2]，因此動(dòng)物性食品中的氯霉素殘留對(duì)人類的健康構(gòu)成了潛在的危害。美國僅允許氯霉素用于非食用動(dòng)物,規(guī)定在動(dòng)物性食品中不得檢出氯霉素，歐盟（EEC）規(guī)定在雞蛋和乳牛中禁止使用氯霉素，在雞肉、肝、腎中的氯霉素殘留量不得超過0.01 mg/kg[2-3]。我國由于檢測(cè)技術(shù)與國外先進(jìn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)存在一定差距，因此常常遇到出口食品氯霉素超標(biāo)問題，每年出口損失高達(dá)數(shù)10億美元[2]。因此研究一種高效、靈敏的氯霉素殘留量檢測(cè)方法勢(shì)在必行，對(duì)我國的進(jìn)出口貿(mào)易以及人民的食品安全意義重大。

氯霉素殘留量的測(cè)定方法有酶聯(lián)免疫法[4]、氣相色譜法[5]、氣質(zhì)聯(lián)用法[6]、液相色譜法[7]和液質(zhì)聯(lián)用法[8-10]等多種方法。酶聯(lián)免疫法具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但僅適用于樣品的快速篩查，在定性及定量的準(zhǔn)確度方面存在一定的局限性。氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法均需要對(duì)氯霉素樣品進(jìn)行衍生化才能進(jìn)行分析，其前處理繁瑣且耗時(shí)較長。液相色譜方法的靈敏度較差，選擇性不好，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。液質(zhì)聯(lián)用方法則是一種高靈敏度、高選擇性的檢測(cè)方法，特別是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式則可進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性，大大降低了檢測(cè)限和假陽性檢測(cè)結(jié)果的出現(xiàn)幾率。

本研究開發(fā)了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析蜂蜜中的氯霉素方法，采用超高效液相色譜作為分離手段，有效地節(jié)省了分析時(shí)間和流動(dòng)相的消耗量，采用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)氯霉素進(jìn)行檢測(cè)，降低了假陽性檢測(cè)結(jié)果的出現(xiàn)機(jī)率，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度，本方法運(yùn)用到實(shí)際樣品的檢測(cè)中結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

氯霉素標(biāo)樣：美國Sigma公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色譜純，美國Fisher公司；18.2 MΩ超純水：賽多利斯超純水機(jī)生產(chǎn)；蜂蜜樣品：云南白塔蜂業(yè)有限公司提供。

1.2 儀器及工作條件

1.2.1 主要儀器及設(shè)備

GL-12B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；NEVAP氮吹儀：美國Organomation公司；CPA225D電子天平：德國Sartorius公司；ACQUITY超高效液相色譜（色譜柱為 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×100 mm）：美國Waters公司；API-3200串聯(lián)質(zhì)譜儀、質(zhì)譜工作站為Analyst質(zhì)譜工作站：美國AB公司。

1.2.2 色譜條件

流動(dòng)相A為水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相梯度見表1，流動(dòng)相流速為0.4mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量 5μL。

表1 氯霉素的梯度洗脫程序Table 1 Gradient of mobile phase

1.2.3 串聯(lián)質(zhì)譜條件

UPLC/MS/MS接口為電噴霧接口（ESI）負(fù)離子模式，離子監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），噴霧電壓（IS）-4 000 V，噴霧氣（GS1）、輔助氣（GS2）、氣簾氣（CUR）、碰撞氣（CAD）均為高純氮?dú)?，噴霧氣氣壓為60 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣氣壓為65 psi，氣簾氣氣壓為20 psi，碰撞氣氣壓為5 psi，輔助噴霧氣溫度為600℃，去簇電壓（DP）為-32.0 V，入口電壓（EP）為-8.0 V，其他參考條件參見表2。

表2 氯霉素定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、采集時(shí)間、碰撞能量和碰撞室出口電壓Table 2 Transitions for confirmation and quantification,time,CE,CXP

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品于燒杯中，用甲醇溶解定容至100mL，得到100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋100倍后得到1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用流動(dòng)相（水∶乙腈=8∶2）逐級(jí)稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液需避光保存在-18℃的冰箱中，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液可穩(wěn)定保存6個(gè)月，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液可穩(wěn)定保存1個(gè)月。

1.4 樣品前處理

稱取蜂蜜樣品 5 g（精確至 0.01 g），置于 50mL 聚丙烯離心管中，加入10mL水于漩渦振蕩器上振蕩1min使蜂蜜完全溶解。準(zhǔn)確加入15mL乙酸乙酯，在振蕩器上振蕩10 min，準(zhǔn)確吸取上層乙酸乙酯10mL轉(zhuǎn)入比色管中，在氮吹儀上55℃氮吹至干，加入5mL水溶解殘?jiān)?。將上?mL水溶液全部轉(zhuǎn)入經(jīng)5mL甲醇和5mL水活化過后的HLB固相萃取柱，以3mL/min的流速通過固相萃取柱后，用10mL水分2次清洗比色管并過柱，然后再用 5mL 乙腈+水（1∶7）淋洗 HLB 小柱，棄去全部淋洗液，在負(fù)壓下對(duì)HLB小柱減壓抽干10min，最后用5mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于10mL比色管中，于 50℃用氮吹儀吹干，用乙腈+水（2∶8）定容至1mL，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾后即可進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

氯霉素分子式為C11H12Cl2N2O5，在電噴霧源（ESI）中易失去一個(gè)氫原子而帶負(fù)電荷，因此選擇ESI負(fù)離子模式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。氯霉素一級(jí)質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 氯霉素一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 The mass spectrum of chloramphenicol

其分子中含有氯元素，因此同位素準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z320.8和m/z322.8。對(duì)320.8的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，發(fā)現(xiàn)其碎片主要有121.0、151.9、175.9、194.0和257.0，見圖2。本方法選取子離子151.9、175.9和257.0進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），以320.8/151.9作為定量離子對(duì)，其他2個(gè)離子對(duì)作為定性離子對(duì)。經(jīng)優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)見1.2.3。

圖2 氯霉素二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 The MS2 spectrum of chloramphenicol

2.2 色譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)中比較了不同流動(dòng)相對(duì)分離度、峰形、靈敏度等的影響。發(fā)現(xiàn)對(duì)于水相來說，水相的酸堿度對(duì)于氯霉素分離影響不大，對(duì)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)也無明顯影響。而有機(jī)相用乙腈比用甲醇時(shí)的氯霉素峰形更好，而且使用乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相更有利于ESI源中溶劑去除。因此試驗(yàn)中采用了水-乙腈的流動(dòng)相體系。

2.3 定量回歸方程及相關(guān)系數(shù)

配制氯霉素濃度分別為 0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次進(jìn)樣后以定量離子對(duì)的峰面積為Y軸，濃度為X軸，進(jìn)行線性回歸得到氯霉素的定量方程為Y=4 020X-19.1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。說明采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣品中的氯霉素進(jìn)行定量具有較好的線性響應(yīng)范圍。

2.4 方法精密度、回收率及檢出限

試驗(yàn)以未檢出氯霉素的蜂蜜作為空白樣品，采用空白樣品加標(biāo)進(jìn)行回收率的測(cè)定，分別進(jìn)行了0.1、0.5、5.0 μg/kg 3個(gè)水平的空白加標(biāo)樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平做5次平行試驗(yàn)，得到平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

表3 方法精密度和回收率（n＝5）Tabble 3 The recovery and precision of method（n＝5）

以本方法進(jìn)樣0.1 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，定量離子對(duì)的信噪比為30.7（圖3），若以信噪比（S/N）等于3時(shí)計(jì)算氯霉素檢出限為0.01 ng/mL，根據(jù)取樣量以及定容體積可計(jì)算出本方法運(yùn)用于實(shí)際蜂蜜樣品時(shí)的檢出限為0.002 5 μg/kg。說明此方法回收率、精密度基本令人滿意，并且具有很高的靈敏度。

圖3 氯霉素標(biāo)樣（0.1 ng/mL）定量離子色譜圖Fig.3 The mass chromatography of chloramphenicol standard(0.1 ng/mL)

2.5 樣品檢測(cè)結(jié)果

按照本文所述方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行分析，圖4為蜂蜜樣品中氯霉素的定量離子色譜圖，從圖4中可以看出，樣品中的氯霉素很好地被分離，基本無干擾峰，且分析時(shí)間很短，只需6 min即可完成一次分析。說明本方法運(yùn)用到實(shí)際樣品的檢測(cè)中可以得到較好的分離分析結(jié)果。

圖4 蜂蜜樣品定量離子色譜圖Fig.4 The mass chromatography of honey sample

3 結(jié)論

本方法采用固相萃取技術(shù)對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行前處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)蜂蜜的氯霉素殘留量。本方法6 min完成一個(gè)樣品分析，分析速度快。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）技術(shù)的應(yīng)用，使方法具有了很高的選擇性和靈敏度。本方法具有準(zhǔn)確、快速、高靈敏度和高選擇性的特點(diǎn)，能夠適應(yīng)大規(guī)模樣品的快速分析要求。

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Determination of Chloramphenicol Residues in Honey by UPLC-MS/MS

FENG Lei，ZHANG Xue-zhong，NIU Zhi-rui，ZHU Hong-kun，LI Bo
（Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Kunming 650223，Yunnan，China）

This thesis concerns about a new analytical approach development of chloramphenicol in honey.Solid-Phase Extraction was used as pretreatment method.After separated by Ultra Performance Liquid Chromatography with acetronitrile-water as mobile phase,than detected the Chloramphenicol residues by MS/MS in the ESI（－）-MRM mode.The pretreatment is efficient.The analytical approach has highly sensitivity and highly selective,the precision is acceptable.So,this new analytical approach has referable value.

chloramphenicol；honey；UPLC-MS/MS；analysis

云南省科技平臺(tái)項(xiàng)目（2009DA022）

馮雷（1979—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：食品中農(nóng)獸藥殘留、非法添加劑的檢測(cè)。

2010-07-13