張忱,李蜀渝,肖波,胡崇宇,劉人愷

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,長沙 410008

張忱,李蜀渝#,肖波,胡崇宇,劉人愷

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,長沙 410008

目的:探討miR-21、m iR-29在癲持續(xù)狀態(tài)(SE)大鼠腦組織和外周血中表達(dá)的變化及意義。方法:SD大鼠30只,隨機(jī)分為SE組20只和對照組10只,SE組建立氯化鋰-匹羅卡品致大鼠SE模型,對照組以生理鹽水代替匹羅卡品,應(yīng)用RT-PCR檢測2組大鼠腦組織和外周血miR-21、miR-29的表達(dá)。結(jié)果:與對照組比較,SE組大鼠海馬區(qū)腦組織和外周血中m iR-21表達(dá)均下降(P＜0.05),miR-29表達(dá)均升高(P＜0.05);miR-21在外周血中的表達(dá)顯著高于腦組織(P＜0.01),m iR-29在外周血中的表達(dá)稍低于腦組織(P＜0.05);結(jié)論:miR-21、miR-29可能參與SE后神經(jīng)元凋亡的調(diào)控過程,外周血miR-21和m iR-29變化可反映腦組織中的變化趨勢。

m iRNA-21;m iRNA-29;癲持續(xù)狀態(tài);匹羅卡品;凋亡

microRNAs(miRNA s)是一種長度為20～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼蛋白的小RNA基因,在動植物細(xì)胞中通過與靶基因特定序列相互作用,在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]。近年來,越來越多的 m iRNAs被發(fā)現(xiàn),并被認(rèn)為參與調(diào)控生物的發(fā)育、神經(jīng)分化、細(xì)胞增殖、凋亡和脂肪代謝等,是細(xì)胞增殖分化和生物體發(fā)育過程中重要的調(diào)控因子[2]。m iR-21、miR-29作為目前研究較多的miRNAs,被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡存在密切聯(lián)系。癲持續(xù)狀態(tài)(status epilep ticus,SE)可引起細(xì)胞凋亡,易致海馬神經(jīng)元損傷,可引起急性和持久性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。本研究建立氯化鋰-匹羅卡品SE模型,探討大鼠SE后海馬區(qū)組織及血液中miR-21、miR-29的表達(dá)變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:6～8周齡清潔級健康雄性Sp rague-Daw ley大鼠30只,由湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供,體質(zhì)量(250±20)g,隨機(jī)分為SE組20只和對照組10只。②主要試劑與材料:T rizol試劑盒(購于Invitrogen公司),M x3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(購于美國Stratagene公司),PCR引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)和合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備 SE組采用腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品方法制備模型[3],腹腔注射氯化鋰125 mg/kg,18～20 h后腹腔注射匹羅卡品20mg/kg,若無性發(fā)作或發(fā)作程度未達(dá)Racine標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ級者,每30 min重復(fù)腹腔注射匹羅卡品10 mg/kg,直至最大劑量60mg/kg。達(dá) Racine標(biāo)準(zhǔn) Ⅳ級超過 30 min以上者為SE模型制備成功。腹腔注射6次后仍未達(dá)到 Ⅳ級者棄用。大鼠SE持續(xù)50min后腹腔注射10%水合氯醛 3 m L/kg終止發(fā)作。對照組用生理鹽水代替匹羅卡品腹腔注射。

1.2.3 總 RNA的提取 取每組各5只大鼠海馬區(qū)腦組織,采用液氮研磨法將組織磨成粉末,血液標(biāo)本經(jīng)淋巴細(xì)胞裂解液處理;加入T rizol混合,按Trizol試劑盒說明抽提總RNA;并進(jìn)行凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。

1.2.4 RT-PCR檢測 miR-21、m iR-29表達(dá)采用m iRNA s定量 RT-PCR檢測試劑盒分別檢測2組大鼠海馬區(qū)腦組織及血液中miR-21、miR-29的表達(dá)量,反應(yīng)在 M x3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成,以U 6作為內(nèi)參基因,引物序列如下:miR-21 F引物:5'-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3 ';miR-21 R引物:5'-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3';miR-29 F引物:5'-CATCTGACTAGCACCATCTGAAAT-3';miR-29 R引物:5'-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理,結(jié)果以(x±s)表示,t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察 對照組大鼠無行為學(xué)變化,SE組20只大鼠均有面部抽搐,17只達(dá)RacineⅣ級,發(fā)作時(shí)間為給藥后15～40 min,平均(24.5±8.7)min。有 3只發(fā)作未達(dá)RacineⅣ級,另有2只在發(fā)作后24 h內(nèi)死亡。

2.2 RNA提取結(jié)果 提取RNA后進(jìn)行凝膠電泳檢測,28 S和18 S電泳條帶清晰,見圖1。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 1、2泳道為對照組腦組織總RNA,3、4泳道為SE組腦組織總RNA,5、6泳道為對照組外周血總RNA,7、8泳道為SE組外周血總RNA

2.3 海馬腦組織miR-21、miR-29表達(dá)變化與對照組比較,SE組大鼠海馬區(qū)腦組織中miR-21表達(dá)水平下降(P＜0.05),miR-29表達(dá)水平升高(P＜0.05),見表1。

表1 2組海馬區(qū)腦組織m iR-21、miR-29表達(dá)比較(x±s,dRn)

2.4 血液中m iR-21、miR-29表達(dá)變化 與對照組比較,SE組大鼠血液中m iR-21表達(dá)水平下降(P＜0.05),miR-29表達(dá)水平升高(P＜0.01),見表2。

表2 2組血液中 miR-21、miR-29表達(dá)比較(x±s,dRn)

2.5 腦組織和血液miRNA的比較 m iR-21在外周血中的表達(dá)量顯著高于腦組織(P＜0.01),見圖2A;miR-29外周血中的表達(dá)稍低于腦組織(P＜0.05),見圖2B。

圖2 A-B 2組腦組織和血液中m iR-21(A)、m iR-29(B)表達(dá)比較

3 討論

miR-21是較早發(fā)現(xiàn)的人類miRNA之一,研究發(fā)現(xiàn)miR-21在人類多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào),起抗凋亡作用。例如SchMittgen等[6]發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌細(xì)胞中,miR-21明顯高表達(dá);Chan等[7]在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)增加5～100倍,當(dāng)miR-21表達(dá)被抑制后Caspase-3活性增加3倍,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡增加、細(xì)胞數(shù)量明顯減少,這表明miR-21表達(dá)與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn),大鼠SE后,在大鼠海馬區(qū)腦組織中miR-21的表達(dá)量低于對照組(P＜0.05)。以往研究表明,在SE后大鼠海馬區(qū)Caspase-3活性蛋白在24 h達(dá)高峰[8],由此表明miR-21在SE后的細(xì)胞凋亡過程中起促進(jìn)作用。Meng等[9]研究發(fā)現(xiàn),抑制miR-21的表達(dá)能夠促進(jìn)化療藥物吉西他濱對膽管癌細(xì)胞引發(fā)的細(xì)胞凋亡,并發(fā)現(xiàn)miR-21的第1個(gè)靶基因PTEN,揭示了miR-21在活化PI3K通路中的作用,初步提示m iR-21的一條抗凋亡途徑。2007年4月Si等[10]研究發(fā)現(xiàn),miR-21的反義核苷酸能夠在體內(nèi)和體外模式中有效抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長,而且這種抑制可能和導(dǎo)致抗凋亡因子BCL-2的下調(diào)有關(guān)。隨后有人陸續(xù)在關(guān)于乳腺癌m iRNA的研究中發(fā)現(xiàn)miR-21的 2個(gè)靶基因:PDCD4和 TPM 1。PDCD 4和 TPM 1屬于凋亡前誘導(dǎo)因子,而miR-21的高表達(dá)下調(diào)了PDCD4和TPM 1[11]。總之從 miR-21的調(diào)控靶基因看,miRNA直接調(diào)控PI3K通路的2個(gè)下游基因PTEN和PDCD4,這是miR-21促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活的原因之一,miR-21還直接調(diào)控凋亡通路中的凋亡促進(jìn)因子N IFB,并受其負(fù)調(diào)控。

miR-29是近年發(fā)現(xiàn)的主要miRNA之一,是血液系統(tǒng)疾病和內(nèi)分泌疾病中的研究熱點(diǎn)。Garzon等[12]研究發(fā)現(xiàn)在急性粒細(xì)胞性白血病外周血白細(xì)胞中miR-29的表達(dá)被抑制,并證明將miR-29轉(zhuǎn)染入白細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外,Xiong等[13]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌組織中miR-29的表達(dá)減少,并且與肝細(xì)胞癌患者的生存率呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),在SE組大鼠海馬區(qū)腦組織中m iR-29的表達(dá)量明顯高于對照組(P＜0.05)。有研究發(fā)現(xiàn)miR-29可抑制抗凋亡分子Bcl-2和M cl-1表達(dá),最終促進(jìn)凋亡。由此表明,SE后海馬組織的miR-29表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究首次對動物腦組織中和外周血中的miRNA s的表達(dá)量進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-29在外周血中均有表達(dá),而且表達(dá)變化的趨勢一致,miR-21的表達(dá)量遠(yuǎn)高于腦組織,而miR-29則與腦組織中基本相近。這提示外周血的 miR-21和m iR-29變化可反映其在腦組織中的變化,其意義有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),在SE后大鼠海馬區(qū)腦組織與外周血中均存在miR-21、m iR-29表達(dá)量的變化,它們均促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,參與SE后神經(jīng)元凋亡的調(diào)控機(jī)制。作為廣泛存在的對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的分子,miRNAs主要是通過抑制它的靶基因而起調(diào)控作用。筆者將在后續(xù)研究中尋找m iR-21、miR-29調(diào)控的靶基因群,對其調(diào)控SE后細(xì)胞凋亡的信號通路進(jìn)行深入探討,以期找到新的防治癲 發(fā)生后神經(jīng)元損傷的方法。

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【編者按】

人類疾病的動物模型是指各種醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動物。借助動物模型，可以更方便、更有效地認(rèn)識人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，研究防治措施。在對神經(jīng)科常見多發(fā)?。ㄈ缒X梗死、腦出血、癲癇及脊髓損傷等）的研究中，動物模型被廣泛使用，具有重要意義。從本期開始，本刊將連續(xù)刊登關(guān)于神經(jīng)科疾病動物模型的相關(guān)文章，以加強(qiáng)對此領(lǐng)域的認(rèn)識。

Expression of miR-21 and m iR-29 in Rats after Pilocarpine Induced Status Epilepticus

ZH ANG Chen▲,LI Shu-Yu,XIAO Bo,HU Chong-Yu,LIU Ren-K ai.▲Department of Neurology,X iangya Hospita l,Centra lSouth University,Changsha 410008,China

Ob jective:To investigate the expression of m iR-21 and miR-29 in the rat brain tissue and peripheral b lood fo llowing status epilep ticus(SE).M ethods:The lithium-pilocapine model of statusepilepticuswasestablished in SD rats.The expression ofmiR-21 and miR-29were examined using RT-PCR.Results:Compared with the controlgroup,SE group show s decreased exp ression ofmiR-21(P＜0.05)as well as increased the exp ression ofmiR-29(P＜0.05)both in brain tissue and peripheral blood.Them iR-21 in peripheral blood was significantly higher than that in brain tissue(P＜0.01);However,themiR-29 in peripheral blood was slight lower than that in brain tissue(P＜0.05).Conclusion:ThemiR-21 andmiR-29may be involved in the neuronal apoptosis processafter SE.The changesofm iR-21 andm iR-29 in peripheralblood could reflect the pathological changes in brain after SE.

miRNA-21;m iRNA-29;statusepilepticus;pilocarpine;apoptosis

R741;R741.02;R742.1

A

1001-117X(2010)03-0166-04

10.3870/sjsscj.2010.03.003

2010-03-02

#【通訊作者】李蜀渝,Tel:86-731-84327216,E-mail:lishuyu63@sina.com。