赫 曼,柴 琛,曹 農(nóng),劉永永,王斌生,俞永江
(1.甘肅省人民醫(yī)院麻醉科,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學第一醫(yī)院普外科,甘肅 蘭州 730000;3.蘭州大學第二醫(yī)院普外科,甘肅 蘭州 730000)
細胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷中的作用
赫 曼1,柴 琛2,曹 農(nóng)2,劉永永3,王斌生2,俞永江2
(1.甘肅省人民醫(yī)院麻醉科,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學第一醫(yī)院普外科,甘肅 蘭州 730000;3.蘭州大學第二醫(yī)院普外科,甘肅 蘭州 730000)
目的 探討細胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷中的作用。方法 成年Wistar大鼠60只,隨機分為4組:(1)陰性對照組(C組):開腹后僅翻動胰腺組織;(2)重癥急性胰腺炎組(S組):3.5%?;悄懰徕c胰膽管逆行注射制造重癥急性胰腺炎(SAP)模型;(3)腹腔灌洗組(W組):復制重癥急性胰腺炎(SAP)模型成功后于胰腺被膜外放置灌洗管,于下腹部留置引流管,生理鹽水行腹腔持續(xù)灌洗;(4)腹腔注射組(E組):取S組大鼠的胰腺勻漿及腹水,于正常大鼠腹腔內(nèi)注射。于造模后3 h、6 h、12 h分批處死大鼠,取肺組織檢測細胞因子NF-κB、TNF-α、IL-1β;對胰腺及肺組織進行病理評分。結(jié)果 S組及E組肺泡間質(zhì)水腫、出血,并有中性粒細胞、巨噬細胞浸潤。在不同時相,S組、W組和E組NF-κB、TNF-α、IL-1β均高于C組(P<0.01),W組升高的幅度小于S組(P<0.05)。結(jié)論 重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水可以導致急性肺損傷,肺組織中NF-κB、TNF-α、IL-1β表達增加,提示這些因子參與急性肺損傷的發(fā)生過程,原因可能與相關(guān)性腹水激活單核-巨噬細胞有關(guān)。早期腹腔灌洗將SAP相關(guān)性腹水進行稀釋并引出體外,減少單核-巨噬細胞的活化,下調(diào)NF-κB、TNF-α、IL-1β,減輕肺損傷的程度,具有較好的治療作用。
細胞因子;重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水;急性肺損傷;腹腔灌洗
重癥急性胰腺炎(SAP)相關(guān)性急性肺損傷是患者早期死亡的主要原因。在發(fā)病過程中,多種細胞因子活化后形成瀑布樣反應(yīng)造成組織和器官的損傷。腹腔灌洗治療在臨床上常能取得較好療效[1],但其分子生物學機制并不清楚。本文就腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷過程中細胞因子的作用機制進行探討。
成年Wistar大鼠60只,體重250~300克,清潔級,將其隨機分為陰性對照組、重癥急性胰腺炎組、腹腔灌洗組、腹腔注射組,每組15只,雌雄不限。
牛磺膽酸鈉(美國Sigma公司生產(chǎn)),髓過氧化物酶試劑盒(南京建成生物工程公司生產(chǎn)),全自動PCR儀(上海復生生物工程研究所有限公司生產(chǎn)),Olympus BX-4顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司生產(chǎn)),TNF-α試劑盒(武漢博士德公司生產(chǎn)),IL-1β試劑盒(武漢博士德公司生產(chǎn)),NF-κB引物(上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)),RT-PCR試劑盒(上海生工生物工程有限公司生產(chǎn))。
2.1.1 陰性對照組(C組)開腹后僅翻動胰腺組織。
2.1.2 重癥急性胰腺炎組(S組) 3.5%?;悄懰徕c胰膽管逆行注射制造重癥急性胰腺炎(SAP)模型。
2.1.3 腹腔灌洗組(W組) 復制SAP模型成功后于胰腺被膜外放置灌洗管,于下腹部留置引流管,以生理鹽水行腹腔持續(xù)灌洗。
2.1.4 腹腔注射組(E組)取SAP模型大鼠的胰腺組織勻漿及腹水,于正常大鼠腹腔內(nèi)注射。
于造模后3 h、6 h、12 h分批處死大鼠,取肺組織1 g,放入凍存管置液氮中冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存,待RT-PCR檢測。另取部分胰腺和肺組織以4%甲醛固定后行鏡下評分,并行肺組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)免疫組化檢測。
引物序列如下[2]:NF-κBp65上游引物:5′-ACGATCTGTTTCC-CCTCATC-3′,下游引物:5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′(221 bp);內(nèi)參照β-actin上游引物:5′-CTGTGCCCATCTATGAGGGT-3′,下游引物:5′-CAGTGAGGCCAGGATAGAGC-3′(526 bp)。RT-PCR反應(yīng)體系:反轉(zhuǎn)錄 37℃ 30 min,預(yù)變性94℃ 2 min,變性94℃15 min,退火55℃30 min,延伸72℃ 30 min,共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。
采用免疫組化SP法檢測TNF-α、IL-1β,按試劑盒說明進行。工作濃度為1∶200,以PBS緩沖液代替一抗作為對照。凡胞漿、胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞定為陽性細胞,綜合陽性表達強度及細胞數(shù)(陽性率)評價陽性結(jié)果。高倍視野下隨機選取10個視野,用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析其灰度值以表示陽性強度。
C組大鼠無死亡;S組死亡1例(6.7%),按Schmidt評分標準[2],SAP13例(86.7%),發(fā)生肺損傷12例[3](80.0%);W組死亡1例(6.7%),SAP12例(80.0%),發(fā)生肺損傷11例(73.3%);E組大鼠無死亡,SAP 5例(33.3%),發(fā)生肺損傷11例(73.3%)。S組大鼠胰腺在鏡下表現(xiàn)為間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤、組織灶性出血壞死及皂化斑形成,E組表現(xiàn)為充血、水腫,罕見出血;S組、W組及E組肺間質(zhì)水腫、出血,并有炎性細胞浸潤。
在不同時相,S組、E 組的肺組織 NF-κB mRNA、TNF-α 和IL-1β表達比C組均有明顯增加,S組與E組相比無明顯變化(見表1、圖1、表2、圖2、表3、圖3)。
表1 不同時相各組NF-κB mRNA的表達(±s)
表1 不同時相各組NF-κB mRNA的表達(±s)
注:與 C 組比較,*P<0.01;與 W 組比較,△P<0.05
?
圖1 各組肺組織NF-κB mRNA的表達情況
表2 不同時相各組TNF-α的表達情況(±s)
表2 不同時相各組TNF-α的表達情況(±s)
注:與 C 組比較,*P<0.01;與 W 組比較,△P<0.05
65.3±2.570.4±1.358.0±3.2201.6±3.6*△144.3±3.0*194.5±3.1*組別 3 h 6 h 12 h C組S組W組E組156.8±3.6*△102.6±1.9*147.5±2.6*184.7±2.4*△135.5±3.4*176.4±1.9*
圖2 腹腔注射組6 h肺組織TNF-α的表達情況(×200)
表3 不同時相各組IL-1β的表達情況(±s)
表3 不同時相各組IL-1β的表達情況(±s)
注:與 C 組比較,*P<0.01;與 W 組比較,△P<0.05
?
圖3 重癥急性胰腺炎組6 h肺組織IL-1β的表達情況(×400)
發(fā)生SAP時含有細胞因子的血性腹水經(jīng)腹膜吸收后導致急性肺損傷及ARDS。在SAP早期進行腹腔灌洗可以減輕器官損害,本文旨在探討細胞因子在腹腔灌洗治療SAP相關(guān)性急性肺損傷中的作用機制。
PAAF經(jīng)腹膜吸收后可以誘發(fā)全身多臟器損害[4]。本研究發(fā)現(xiàn),S組胰腺組織存在不同程度的間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤、胰腺組織灶性或片狀出血壞死及皂化斑形成,伴有血性腹水,呈典型的SAP病理改變[5]。由PAAF誘發(fā)的胰腺病變程度較輕,僅有部分腺體組織水腫,少量炎性細胞浸潤。大鼠腹腔注射PAAF后誘發(fā)了肺損傷,肺臟表現(xiàn)為肺間質(zhì)水腫及出血、肺泡間隔增寬,部分肺泡融合或萎縮,肺間質(zhì)中大量中性粒細胞浸潤及巨噬細胞浸潤,部分小支氣管上皮細胞脫落,可見微血栓。其病理改變與相關(guān)報道一致[6]。
已有研究表明,胰酶在SAP相關(guān)性肺損傷中起非常重要的作用[7~8]。除此以外,細胞因子被激活后形成的復雜網(wǎng)絡(luò)導致器官的進一步損害。
4.2.1 NF-κB致肺損傷的作用機制 NF-κB活化是眾多炎癥介質(zhì)作用的共同通道[9]。炎癥反應(yīng)過程中,NF-κB被激活后由胞漿進入核內(nèi),與其靶基因上的啟動子或增強子結(jié)合,進而調(diào)控多種細胞因子和免疫介質(zhì)的表達,進一步促發(fā)炎癥反應(yīng)。
本實驗顯示,陰性對照組肺臟組織中NF-κB mRNA呈低表達;在大鼠腹腔注射SAP相關(guān)性腹水后,肺組織NF-κB mRNA的表達逐漸增強,與陰性對照組相比有顯著性差異。證實SAP相關(guān)性腹水通過腹膜吸收后激活了單核-巨噬細胞,使NF-κB活化而造成肺損傷。腹腔灌洗后,NF-κB mRNA的表達下調(diào)。近年的實驗研究也提示[10~12],急性重癥胰腺炎時有NF-κB活化及其調(diào)控的細胞因子及趨化因子基因表達的增加。阻斷NF-κB激活通路上的某個環(huán)節(jié)有可能成為治療SAP的重要手段。除了本實驗中的腹腔灌洗外,NF-κB可以被TNF-α抗體、血小板活化因子(PAF)拮抗劑及抗中性粒細胞血清等不同程度地抑制,從而降低血清淀粉酶活性,減輕胰腺組織水腫和肺損傷的程度[13]。
4.2.2 TNF-α致肺損傷的作用機制 TNF-α是由單核-巨噬細胞、T細胞和肥大細胞等產(chǎn)生的一種細胞因子,是免疫的重要介質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn):在不同時相,重癥急性胰腺炎組、腹腔注射組肺組織TNF-α的表達水平均高于陰性對照組,與其受損害程度相一致,提示TNF-α在SAP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。同時腹腔注射組TNF-α的高表達也說明了TNF-α是SAP相關(guān)性腹水造成肺損傷的因素之一。經(jīng)過腹腔灌洗后,TNF-α的表達下降,肺損傷程度減輕。TNF-α是胰腺炎時最早升高的細胞因子,它與SAP的嚴重程度密切相關(guān),是判斷SAP嚴重程度和預(yù)后的重要指標[14~15]。應(yīng)用可溶性TNF受體可阻斷TNF表達,顯著降低胰腺組織水腫,下調(diào)血清淀粉酶、脂肪酶水平,并能顯著降低實驗動物的死亡率[16]。TNF-α可以激活中性粒細胞等炎癥細胞使后者釋放大量介質(zhì)造成組織損傷;激活其他細胞因子如IL-1、IL-6等形成炎癥瀑布反應(yīng),進一步加重組織損傷;增加肺血管通透性,使肺間質(zhì)水腫,促使ARDS的發(fā)生[17]。
4.2.3 IL-1β致肺損傷的作用機制 IL-1β與SAP關(guān)系密切,主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生。IL-1β可直接刺激胰酶的產(chǎn)生和誘發(fā)其他促炎細胞因子的產(chǎn)生,激活中性粒細胞造成多器官功能衰竭。本研究結(jié)果顯示:在正常大鼠腹腔注射SAP相關(guān)性腹水的早期,IL-1β的表達就有所升高;在不同時相,IL-1β的表達均高于陰性對照組,與肺損傷的嚴重程度相一致。腹腔灌洗后,IL-1β的表達下調(diào)。為拮抗IL-1β對器官的損害,有學者發(fā)現(xiàn)給予大劑量IL-1受體拮抗劑后能明顯降低SAP實驗動物的病死率,減少中性粒細胞在肺中的積聚,減輕肺損傷的程度[18~19]。
SAP相關(guān)性腹水含有胰酶等大量的毒性物質(zhì)、血管活性物質(zhì)及蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物,這些物質(zhì)通過腹膜不斷吸收后過度激活炎性細胞,使炎性細胞釋放大量的細胞因子及炎性介質(zhì)[20],促使全身炎性反應(yīng)綜合癥的發(fā)生。因此,在早期進行持續(xù)腹腔灌洗可阻斷炎性因子經(jīng)腹膜吸收途徑,降低病死率,減少并發(fā)癥的發(fā)生[21~22]。本研究發(fā)現(xiàn):經(jīng)過腹腔灌洗后,血清中細胞因子水平下調(diào),減輕了肺損傷。Ranson[23]在1990年的隨機對照研究中認為長時間腹腔灌洗不僅可以減少肺部的并發(fā)癥,而且可以降低胰腺壞死組織感染的并發(fā)癥及相關(guān)的病死率。
綜上所述,重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水經(jīng)腹膜吸收后可以導致肺損傷,NF-κB、TNF-α、IL-1β表達升高提示其參與了急性肺損傷的發(fā)生過程,原因可能與重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水激活了單核-巨噬細胞有關(guān)。早期腹腔灌洗將重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水進行稀釋并引出體外,減少了腹膜單核-巨噬細胞的活化,降低了細胞因子的表達水平,減輕了肺損傷的程度,具有較好的治療作用。
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甘肅省科技攻關(guān)計劃項目(0709TCYA057)