赫 曼，柴 琛，曹 農(nóng)，劉永永，王斌生，俞永江

（1.甘肅省人民醫(yī)院麻醉科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000）

細(xì)胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷中的作用

赫 曼1，柴 琛2，曹 農(nóng)2，劉永永3，王斌生2，俞永江2

（1.甘肅省人民醫(yī)院麻醉科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，甘肅 蘭州 730000）

目的 探討細(xì)胞因子在腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷中的作用。方法 成年Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為4組：（1）陰性對照組（C組）：開腹后僅翻動胰腺組織；（2）重癥急性胰腺炎組（S組）：3.5%?；悄懰徕c胰膽管逆行注射制造重癥急性胰腺炎（SAP）模型；（3）腹腔灌洗組（W組）：復(fù)制重癥急性胰腺炎（SAP）模型成功后于胰腺被膜外放置灌洗管，于下腹部留置引流管，生理鹽水行腹腔持續(xù)灌洗；（4）腹腔注射組（E組）：取S組大鼠的胰腺勻漿及腹水，于正常大鼠腹腔內(nèi)注射。于造模后3 h、6 h、12 h分批處死大鼠，取肺組織檢測細(xì)胞因子NF-κB、TNF-α、IL-1β；對胰腺及肺組織進(jìn)行病理評分。結(jié)果 S組及E組肺泡間質(zhì)水腫、出血，并有中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤。在不同時相，S組、W組和E組NF-κB、TNF-α、IL-1β均高于C組（P＜0.01），W組升高的幅度小于S組（P＜0.05）。結(jié)論 重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水可以導(dǎo)致急性肺損傷，肺組織中NF-κB、TNF-α、IL-1β表達(dá)增加，提示這些因子參與急性肺損傷的發(fā)生過程，原因可能與相關(guān)性腹水激活單核-巨噬細(xì)胞有關(guān)。早期腹腔灌洗將SAP相關(guān)性腹水進(jìn)行稀釋并引出體外，減少單核-巨噬細(xì)胞的活化，下調(diào)NF-κB、TNF-α、IL-1β，減輕肺損傷的程度，具有較好的治療作用。

細(xì)胞因子；重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水；急性肺損傷；腹腔灌洗

重癥急性胰腺炎（SAP）相關(guān)性急性肺損傷是患者早期死亡的主要原因。在發(fā)病過程中，多種細(xì)胞因子活化后形成瀑布樣反應(yīng)造成組織和器官的損傷。腹腔灌洗治療在臨床上常能取得較好療效[1]，但其分子生物學(xué)機(jī)制并不清楚。本文就腹腔灌洗治療重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷過程中細(xì)胞因子的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

成年Wistar大鼠60只，體重250～300克，清潔級，將其隨機(jī)分為陰性對照組、重癥急性胰腺炎組、腹腔灌洗組、腹腔注射組，每組15只，雌雄不限。

1.2 主要實驗試劑與儀器

牛磺膽酸鈉（美國Sigma公司生產(chǎn)），髓過氧化物酶試劑盒（南京建成生物工程公司生產(chǎn)），全自動PCR儀（上海復(fù)生生物工程研究所有限公司生產(chǎn)），Olympus BX-4顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司生產(chǎn)），TNF-α試劑盒（武漢博士德公司生產(chǎn)），IL-1β試劑盒（武漢博士德公司生產(chǎn)），NF-κB引物（上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)），RT-PCR試劑盒（上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制

2.1.1 陰性對照組（C組）開腹后僅翻動胰腺組織。

2.1.2 重癥急性胰腺炎組（S組） 3.5%牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射制造重癥急性胰腺炎（SAP）模型。

2.1.3 腹腔灌洗組（W組） 復(fù)制SAP模型成功后于胰腺被膜外放置灌洗管，于下腹部留置引流管，以生理鹽水行腹腔持續(xù)灌洗。

2.1.4 腹腔注射組（E組）取SAP模型大鼠的胰腺組織勻漿及腹水，于正常大鼠腹腔內(nèi)注射。

2.2 標(biāo)本采集

于造模后3 h、6 h、12 h分批處死大鼠，取肺組織1 g，放入凍存管置液氮中冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，待RT-PCR檢測。另取部分胰腺和肺組織以4%甲醛固定后行鏡下評分，并行肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）免疫組化檢測。

2.3 RT-PCR檢測肺組織核因子-κB（NF-κB）mRNA的表達(dá)

引物序列如下[2]：NF-κBp65上游引物：5′-ACGATCTGTTTCC－CCTCATC-3′，下游引物：5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′（221 bp）；內(nèi)參照β-actin上游引物：5′-CTGTGCCCATCTATGAGGGT-3′，下游引物：5′-CAGTGAGGCCAGGATAGAGC-3′（526 bp）。RT-PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄 37℃ 30 min，預(yù)變性94℃ 2 min，變性94℃15 min，退火55℃30 min，延伸72℃ 30 min，共35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

2.4 TNF-α、IL-1β的檢測

采用免疫組化SP法檢測TNF-α、IL-1β，按試劑盒說明進(jìn)行。工作濃度為1∶200，以PBS緩沖液代替一抗作為對照。凡胞漿、胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞定為陽性細(xì)胞，綜合陽性表達(dá)強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)（陽性率）評價陽性結(jié)果。高倍視野下隨機(jī)選取10個視野，用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析其灰度值以表示陽性強(qiáng)度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組動物死亡率和造模成功率比較

C組大鼠無死亡；S組死亡1例（6.7%），按Schmidt評分標(biāo)準(zhǔn)[2]，SAP13例（86.7%），發(fā)生肺損傷12例[3]（80.0%）；W組死亡1例（6.7%），SAP12例（80.0%），發(fā)生肺損傷11例（73.3%）；E組大鼠無死亡，SAP 5例（33.3%），發(fā)生肺損傷11例（73.3%）。S組大鼠胰腺在鏡下表現(xiàn)為間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤、組織灶性出血壞死及皂化斑形成，E組表現(xiàn)為充血、水腫，罕見出血；S組、W組及E組肺間質(zhì)水腫、出血，并有炎性細(xì)胞浸潤。

3.2 肺組織NF-κB mRNA、TNF-α和IL-1β表達(dá)變化

在不同時相，S組、E 組的肺組織 NF-κB mRNA、TNF-α 和IL-1β表達(dá)比C組均有明顯增加，S組與E組相比無明顯變化（見表1、圖1、表2、圖2、表3、圖3）。

表1 不同時相各組NF-κB mRNA的表達(dá)（±s）

表1 不同時相各組NF-κB mRNA的表達(dá)（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

?

圖1 各組肺組織NF-κB mRNA的表達(dá)情況

表2 不同時相各組TNF-α的表達(dá)情況（±s）

表2 不同時相各組TNF-α的表達(dá)情況（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

65.3±2.570.4±1.358.0±3.2201.6±3.6*△144.3±3.0*194.5±3.1*組別 3 h 6 h 12 h C組S組W組E組156.8±3.6*△102.6±1.9*147.5±2.6*184.7±2.4*△135.5±3.4*176.4±1.9*

圖2 腹腔注射組6 h肺組織TNF-α的表達(dá)情況（×200）

表3 不同時相各組IL-1β的表達(dá)情況（±s）

表3 不同時相各組IL-1β的表達(dá)情況（±s）

注：與 C 組比較，*P＜0.01；與 W 組比較，△P＜0.05

?

圖3 重癥急性胰腺炎組6 h肺組織IL-1β的表達(dá)情況（×400）

4 討論

發(fā)生SAP時含有細(xì)胞因子的血性腹水經(jīng)腹膜吸收后導(dǎo)致急性肺損傷及ARDS。在SAP早期進(jìn)行腹腔灌洗可以減輕器官損害，本文旨在探討細(xì)胞因子在腹腔灌洗治療SAP相關(guān)性急性肺損傷中的作用機(jī)制。

4.1 SAP相關(guān)性腹水（PAAF）誘導(dǎo)肺損傷模型的建立

PAAF經(jīng)腹膜吸收后可以誘發(fā)全身多臟器損害[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，S組胰腺組織存在不同程度的間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤、胰腺組織灶性或片狀出血壞死及皂化斑形成，伴有血性腹水，呈典型的SAP病理改變[5]。由PAAF誘發(fā)的胰腺病變程度較輕，僅有部分腺體組織水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤。大鼠腹腔注射PAAF后誘發(fā)了肺損傷，肺臟表現(xiàn)為肺間質(zhì)水腫及出血、肺泡間隔增寬，部分肺泡融合或萎縮，肺間質(zhì)中大量中性粒細(xì)胞浸潤及巨噬細(xì)胞浸潤，部分小支氣管上皮細(xì)胞脫落，可見微血栓。其病理改變與相關(guān)報道一致[6]。

4.2 重癥急性胰腺炎相關(guān)性急性肺損傷（APALI）的發(fā)生機(jī)制

已有研究表明，胰酶在SAP相關(guān)性肺損傷中起非常重要的作用[7～8]。除此以外，細(xì)胞因子被激活后形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致器官的進(jìn)一步損害。

4.2.1 NF-κB致肺損傷的作用機(jī)制 NF-κB活化是眾多炎癥介質(zhì)作用的共同通道[9]。炎癥反應(yīng)過程中，NF-κB被激活后由胞漿進(jìn)入核內(nèi)，與其靶基因上的啟動子或增強(qiáng)子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控多種細(xì)胞因子和免疫介質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)一步促發(fā)炎癥反應(yīng)。

本實驗顯示，陰性對照組肺臟組織中NF-κB mRNA呈低表達(dá)；在大鼠腹腔注射SAP相關(guān)性腹水后，肺組織NF-κB mRNA的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與陰性對照組相比有顯著性差異。證實SAP相關(guān)性腹水通過腹膜吸收后激活了單核-巨噬細(xì)胞，使NF-κB活化而造成肺損傷。腹腔灌洗后，NF-κB mRNA的表達(dá)下調(diào)。近年的實驗研究也提示[10～12]，急性重癥胰腺炎時有NF-κB活化及其調(diào)控的細(xì)胞因子及趨化因子基因表達(dá)的增加。阻斷NF-κB激活通路上的某個環(huán)節(jié)有可能成為治療SAP的重要手段。除了本實驗中的腹腔灌洗外，NF-κB可以被TNF-α抗體、血小板活化因子（PAF）拮抗劑及抗中性粒細(xì)胞血清等不同程度地抑制，從而降低血清淀粉酶活性，減輕胰腺組織水腫和肺損傷的程度[13]。

4.2.2 TNF-α致肺損傷的作用機(jī)制 TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞等產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，是免疫的重要介質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)：在不同時相，重癥急性胰腺炎組、腹腔注射組肺組織TNF-α的表達(dá)水平均高于陰性對照組，與其受損害程度相一致，提示TNF-α在SAP的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。同時腹腔注射組TNF-α的高表達(dá)也說明了TNF-α是SAP相關(guān)性腹水造成肺損傷的因素之一。經(jīng)過腹腔灌洗后，TNF-α的表達(dá)下降，肺損傷程度減輕。TNF-α是胰腺炎時最早升高的細(xì)胞因子，它與SAP的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，是判斷SAP嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要指標(biāo)[14～15]。應(yīng)用可溶性TNF受體可阻斷TNF表達(dá)，顯著降低胰腺組織水腫，下調(diào)血清淀粉酶、脂肪酶水平，并能顯著降低實驗動物的死亡率[16]。TNF-α可以激活中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞使后者釋放大量介質(zhì)造成組織損傷；激活其他細(xì)胞因子如IL-1、IL-6等形成炎癥瀑布反應(yīng)，進(jìn)一步加重組織損傷；增加肺血管通透性，使肺間質(zhì)水腫，促使ARDS的發(fā)生[17]。

4.2.3 IL-1β致肺損傷的作用機(jī)制 IL-1β與SAP關(guān)系密切，主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IL-1β可直接刺激胰酶的產(chǎn)生和誘發(fā)其他促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，激活中性粒細(xì)胞造成多器官功能衰竭。本研究結(jié)果顯示：在正常大鼠腹腔注射SAP相關(guān)性腹水的早期，IL-1β的表達(dá)就有所升高；在不同時相，IL-1β的表達(dá)均高于陰性對照組，與肺損傷的嚴(yán)重程度相一致。腹腔灌洗后，IL-1β的表達(dá)下調(diào)。為拮抗IL-1β對器官的損害，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)給予大劑量IL-1受體拮抗劑后能明顯降低SAP實驗動物的病死率，減少中性粒細(xì)胞在肺中的積聚，減輕肺損傷的程度[18～19]。

4.3 腹腔灌洗的治療作用

SAP相關(guān)性腹水含有胰酶等大量的毒性物質(zhì)、血管活性物質(zhì)及蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，這些物質(zhì)通過腹膜不斷吸收后過度激活炎性細(xì)胞，使炎性細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)[20]，促使全身炎性反應(yīng)綜合癥的發(fā)生。因此，在早期進(jìn)行持續(xù)腹腔灌洗可阻斷炎性因子經(jīng)腹膜吸收途徑，降低病死率，減少并發(fā)癥的發(fā)生[21～22]。本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過腹腔灌洗后，血清中細(xì)胞因子水平下調(diào)，減輕了肺損傷。Ranson[23]在1990年的隨機(jī)對照研究中認(rèn)為長時間腹腔灌洗不僅可以減少肺部的并發(fā)癥，而且可以降低胰腺壞死組織感染的并發(fā)癥及相關(guān)的病死率。

綜上所述，重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水經(jīng)腹膜吸收后可以導(dǎo)致肺損傷，NF-κB、TNF-α、IL-1β表達(dá)升高提示其參與了急性肺損傷的發(fā)生過程，原因可能與重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水激活了單核-巨噬細(xì)胞有關(guān)。早期腹腔灌洗將重癥急性胰腺炎相關(guān)性腹水進(jìn)行稀釋并引出體外，減少了腹膜單核-巨噬細(xì)胞的活化，降低了細(xì)胞因子的表達(dá)水平，減輕了肺損傷的程度，具有較好的治療作用。

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G424.31

B

1671-1246（2010）14-0136-04

甘肅省科技攻關(guān)計劃項目（0709TCYA057）