范巧蘭，陳 耕，李永山，柴永峰，張冬梅，李燕娥

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運城044000）

近年來，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)業(yè)化研究取得了很大成就[1]，目前至少有26種作物和樹木利用轉(zhuǎn)Bt基因進行蟲害控制。根據(jù)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國際服務(wù)組織（ISAAA）的最新報告[2]，2008年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達1.25×104萬hm2，共有25個國家種植，其中，轉(zhuǎn)基因棉花種植面積達0.155×104萬hm2，占總量的12%。自Perlak等[3]首次成功將蘇云金桿菌的殺蟲基因轉(zhuǎn)入棉花獲得抗蟲植株后，抗蟲棉進入應(yīng)用階段。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉是我國批準可以大規(guī)模商品化種植的轉(zhuǎn)基因植物，隨著轉(zhuǎn)基因植物商品化進程的加快，轉(zhuǎn)基因植物的風(fēng)險評價倍受人們的關(guān)注[4-7]。對轉(zhuǎn)基因棉花的安全評價主要集中在地上部生態(tài)系統(tǒng)[8-11]，而轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對土壤微生物的影響研究也逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點[12-18]。評價轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義。

本研究比較了不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)Bt基因棉花和常規(guī)棉花根際土壤細菌、放線菌和真菌以及不同生理菌群數(shù)量的變化，以期為建立轉(zhuǎn)基因植物對土壤生態(tài)風(fēng)險評價體系提供參考。

1 材料和方法

1.1 棉花品種

供試轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉品種晉棉26號和具有相似遺傳背景的常規(guī)棉花品種晉棉7號（CK）都是陸地棉（Gossypium hirsutum L）品種，分別由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所生物技術(shù)室和棉花資源組提供。晉棉26號是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt基因轉(zhuǎn)化到晉棉7號中選育的抗蟲棉品種。

1.2 試驗地概況

大田試驗于2009年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所農(nóng)場（運城）進行。試驗地為黃壤土，肥力中等偏上，有機質(zhì)含量0.89%，速效氮含量65 mg/kg，速效磷含量7 mg/kg，速效鉀含量86 mg/kg，土壤pH為7.12。試驗地?zé)o黃萎病和枯萎病，前茬種植作物為棉花。試驗小區(qū)面積為6 m×5 m，重復(fù)3次，4月10日播種，寬窄行種植，地膜覆蓋，棉田管理同生產(chǎn)條件下的大田管理。

1.3 取樣

在棉花全生育期間，于苗期、蕾期、花鈴期、吐絮期、收獲期分別取大田棉花窄行土樣。

1.4 根際微生物的培養(yǎng)與記數(shù)

根際細菌、放線菌和真菌數(shù)量的測定采用稀釋平板測數(shù)法，培養(yǎng)基分別為牛肉膏蛋白胨、高氏1號和馬丁培養(yǎng)基。在土壤細菌功能群中，好氣固氮菌、好氣性纖維分解菌、氨化細菌用稀釋平板法分離記數(shù)。細菌生理群的培養(yǎng)基參照文獻［19］介紹的方法進行配制。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用DPS統(tǒng)計軟件進行分析，平均數(shù)用LSD法進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因棉花對土壤細菌的影響

研究表明，細菌是土壤微生物最大的優(yōu)勢種群。轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號與非轉(zhuǎn)基因親本晉棉7號相比，除吐絮期外，其他生育期土壤細菌數(shù)量明顯增加（表1）。苗期、蕾期、花期和收獲期轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號比對照晉棉7號分別提高10.46%，15.60%，8.17%和47.57%，經(jīng)t檢驗，差異均達到顯著水平。

表1 轉(zhuǎn)基因棉花不同生育期對土壤細菌的影響 ×105cfu/g

2.2 轉(zhuǎn)基因棉花對土壤真菌的影響

研究表明，轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號與非轉(zhuǎn)基因親本晉棉7號相比，土壤真菌數(shù)量差異均達到顯著水平。苗期、蕾期、花期和收獲期轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號比對照晉棉7號分別提高87.40%，27.50%，49.77%和26.28%，經(jīng)t檢驗，差異均達顯著水平，而吐絮期轉(zhuǎn)基因棉花真菌數(shù)量顯著低于對照（表2）。

表2 轉(zhuǎn)基因棉花不同生育期對土壤真菌的影響 ×103cfu/g

2.3 轉(zhuǎn)基因棉花對土壤放線菌的影響

研究表明，轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號與非轉(zhuǎn)基因親本晉棉7號相比，苗期土壤放線菌數(shù)量降低31.27%，差異達到顯著水平；收獲期僅降低2.69%，差異未達到顯著水平；而在蕾期、花期和吐絮期分別比對照提高80.46%，100.69%和38.56%，差異達到顯著水平（表3）。

表3 轉(zhuǎn)基因棉花不同生育期對土壤放線菌的影響 ×105cfu/g

2.4 轉(zhuǎn)基因棉花對土壤生理功能菌群的影響

2.4.1 對土壤氨化細菌的影響 試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號在蕾期、吐絮期、收獲期土壤氨化細菌數(shù)量比對照晉棉7號分別增加44.75%，14.79%和27.96%，且差異均達到顯著水平；而在苗期和花期比對照晉棉7號分別降低18.29%和6.30%（表4）。

2.4.2 對土壤固氮菌的影響 試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號在苗期、花期、吐絮期、收獲期的土壤固氮菌數(shù)量分別比對照晉棉7號增加12.9%，100%，76.0%和14.3%，而在蕾期卻降低26.4%，差異均達到顯著水平（表5）。

表4 轉(zhuǎn)基因棉花不同生育期對土壤氨化細菌的影響 ×105cfu/g

表5 轉(zhuǎn)基因棉花不同生育期對土壤固氮菌的影響 ×103cfu/g

2.4.3 對土壤纖維菌的影響 試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號在苗期、花期和收獲期的土壤纖維菌數(shù)量比非轉(zhuǎn)基因親本晉棉7號分別增加75.87%，134.32%和2.37%，而在蕾期和吐絮期比晉棉7號降低9.34%和74.06%。

表6 轉(zhuǎn)基因棉花不同生育期對土壤纖維菌的影響 ×103cfu/g

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花對土壤微生物有明顯的影響，但在各個生育期各種微生物種類及其生理群表現(xiàn)不太一致。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對土壤中微生物數(shù)量的影響，主要原因是Bt棉的外源基因表達產(chǎn)物Bt殺蟲晶體蛋白通過根系分泌物或作物殘茬進入土壤生態(tài)系統(tǒng)[20]。Donegan等[12]研究發(fā)現(xiàn)，美國種植的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉土壤微生物的數(shù)量與種類在不同品種中表現(xiàn)不一致；Watrud等也報道，轉(zhuǎn)Bt基因棉花提高了土壤細菌和真菌的數(shù)量。我國學(xué)者研究表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對土壤微生物種類及數(shù)量有影響[15-18]。同時，也有研究認為，轉(zhuǎn)Bt基因棉可能是由于遺傳修飾后植株的生理生化特性發(fā)生了變化，從而對土壤微生物產(chǎn)生影響，而不是表達產(chǎn)物的直接影響[11]。

隨著轉(zhuǎn)基因棉花的連續(xù)種植，根系分泌物和秸稈殘葉進入土壤生態(tài)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)基因棉花對土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及其土壤生態(tài)安全的影響還有待進一步研究。

［1］ 李靜，李紅芳，張換樣，等.全球轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：3-8.

［2］ James C.Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops:2008[EB/OL].[2009-11-12].http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/39/executive summary/default.html.

［3］ Perlak Frederick J，Deaton R W，Armstrong T A，et al.Insect resistant cotton plants[J].Bio/Technology，1990，8：939-942.

［4］ 錢迎倩，馬克平.經(jīng)遺傳修飾生物體的研究進展及其釋放后對環(huán)境的影響[J].生態(tài)學(xué)報，1998，18（1）：1-9.

［5］ Wolfenbarger L L.The ecological risks and benefits of geneticallyengineered plants[J].Science，2000，290：2088-2093.

［6］ Angle J S.Release of transgenic plants:biodiversity and population considerations[J].Molecular Ecology，1994，3：45-50.

［7］ 沈法富，于元杰，張學(xué)坤，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的基因流[J].遺傳學(xué)報，2001，28（6）：562-567.

［8］ 李汝忠，沈法富，王宗文，等.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲性遺傳研究[J].棉花學(xué)報，2001，13（5）：268-272.

［9］ 王留明，王家寶，沈法富，等.漬澇與干旱對不同轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的影響[J].棉花學(xué)報，2001，13（2）：87-90.

［10］ 丁志勇，許崇任，王戎疆.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與常規(guī)棉幾種同工酶的比較[J].生態(tài)學(xué)報，2001，21（2）：332-336.

［11］ 閻鳳鳴.轉(zhuǎn)Bt基因棉揮發(fā)性氣味的化學(xué)成分及其對棉鈴蟲的電生理活性[J].昆蟲學(xué)報，2002，45（4）：425-429.

［12］ Donegan K K，Palm C J.Changes in levels，species，and DNA fingerprints of soil microorganisms associated with cotton expressing the Bacillus thuringiensis var.kurstaki endotoxin[J].Applied Soil Ecology，1995，2：111-124.

［13］ 崔金杰.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對土壤微生物影響的初步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，28（6）：73-75.

［14］ 張金國.轉(zhuǎn)基因(Cry1Ac)抗蟲棉對土壤微生物的影響[J].中國生物工程雜志，2006，26（5）：78-80.

［15］ 沈法富.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉根際微生物區(qū)系和細菌生理群多樣性的變化[J].生態(tài)學(xué)報，2004，24（3）：432-437.

［16］ 李永山，范巧蘭，陳耕，等.轉(zhuǎn)Bt基因棉花對土壤微生物的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，26（增刊）：533-536.

［17］ 李永山.利用PLFA方法研究轉(zhuǎn)Bt基因棉花對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響[J].棉花學(xué)報，2009，21（6）：503-507.

［18］ 雒珺瑜，崔金杰，李樹紅，等.不同棉花品種對土壤微生物的影響[J].中國棉花，2005（9）：10.

［19］ 許光輝，鄭洪元.土壤微生物分析方法手冊[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986.

［20］ 孫彩霞.Bt殺蟲晶體蛋白的土壤殘留及其對土壤磷酸酶活性的影響[J].土壤學(xué)報，2004，41（5）：761-765.