李 瑾,伊艷杰,時 玉,袁 元,李俊霞,張慧茹

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,河南鄭州 450001)

高抑菌活性的金銀花內(nèi)生真菌的 ITS序列分析法鑒定

李 瑾,伊艷杰,時 玉,袁 元,李俊霞,張慧茹＊

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,河南鄭州 450001)

采用分子生物學(xué)方法,對金銀花中分離的 2株具有高抑菌活性的內(nèi)生真菌 JY2和 JY9的 r DNA中的 ITS序列進(jìn)行了測序和分析.結(jié)果表明:JY2與鐮刀菌屬的同源性達(dá)到 99%以上,判定為鐮刀菌屬;JY9與現(xiàn)有相似序列的同源性都不高,只能推測其可能為子囊菌門,與原形態(tài)學(xué)鑒定的赤霉屬有差別.

金銀花;內(nèi)生真菌;ITS序列

0 前言

藥用植物內(nèi)生菌是新型抗病藥物的重要來源.金銀花 (Flos Lonicerae)為常用傳統(tǒng)中藥,具有清熱解毒、增強(qiáng)免疫、抑殺多種病原微生物、消除耐藥質(zhì)粒等功效.前期,筆者從金銀花中分離到 2株具有高抑菌活性的內(nèi)生真菌[1],對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的廣譜抑菌活性,且其有效成分具有一定的耐熱性和耐酸、堿性,適宜在生產(chǎn)中進(jìn)行加工和制備,具有很好的應(yīng)用前景.目前,國內(nèi)外有關(guān)金銀花抗菌內(nèi)生真菌的研究報道尚未查閱到.作者采用 ITS序列分析方法,對分離的金銀花內(nèi)生真菌JY2和JY9進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,旨在為下一步深入研究金銀花內(nèi)生真菌的藥用價值提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

JY2、JY9菌株均為河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院動物生理實(shí)驗(yàn)室分離得到.

1.1.2 試劑

基因組DNA提取試劑、Taq酶和 PCR相關(guān)試劑:北京百泰克生物技術(shù)有限公司;載體連接試劑盒:寶生生物工程(大連)有限公司.

1.1.3 PCR引物

采用真菌 ITS序列鑒定通用引物 ITS4、ITS5,其序列分別為:ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(20 bp);ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(22 bp),由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的活化

將JY2和 JY9菌株在 PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng) 4～5 d,從菌落邊緣挑取適量的菌絲,轉(zhuǎn)接于裝有 100 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中,28℃,160 r/min振蕩培養(yǎng) 4 d,取出放入 4℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 內(nèi)生真菌總DNA的制備

取 10 mL菌液加入離心管中,4℃、8 000r/min離心 10 min,棄上清液,用乙醇清洗 1次.收集大約 3 g沉淀置于 -20℃預(yù)冷的研缽中,加少許裂解緩沖液進(jìn)行研磨約5 min,轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中.加 65%預(yù)熱的裂解緩沖液 2 mL和 2% SDS 2 mL充分搖勻后,65℃恒溫作用 30～40 min,每隔 10 min輕輕顛倒搖勻離心管數(shù)次.然后6 000 r/min離心 5 min去除沉淀,取上清液,加1/5體積的 5×CTAB,65℃恒溫作用 10 min,取出冷卻后加等體積的氯仿異戊醇 (V∶V=24∶1),緩慢倒轉(zhuǎn)離心管,使溶液成乳狀并保持 2 min, 6 000 r/min離心 10 min,取上清液再轉(zhuǎn)至另一離心管,加氯仿異戊醇抽提,直到界面清晰.將上清液轉(zhuǎn)至另一離心管后,加 -20℃預(yù)冷 95%乙醇,于 -20℃放置 30 min～1 h,12 000 r/min離心,加適量 1×TE緩沖液,-4℃保存.

1.2.3 目的片段的 PCR擴(kuò)增

以真菌 rDNA-ITS擴(kuò)增的通用引物 ITS4和ITS5為上、下游引物,擴(kuò)增內(nèi)生真菌的 ITS序列. PCR反應(yīng)體系為 (25μL):10×PCR緩沖液 2.5 μL,DNA模板 2μL,dNTP 2μL,buffer 2.5μL, 5μmol/L的上下游引物各 1μL,Taq酶 1 U,用超純水補(bǔ)齊剩余體積.

PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性 5 min,94℃變性 30 s、55℃退火 1 min、72℃延伸 2 min,35個循環(huán),72℃延伸 10 min,4℃保溫.

PCR產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,利用B IORAD凝膠成像系統(tǒng)照相.

1.2.4 ITS片段的連接與轉(zhuǎn)化

將擴(kuò)增的 ITS片段用連接試劑盒連接到PMD18-TVector載體上,參照連接試劑盒的操作說明進(jìn)行連接.連接體系為 10μL:Solution9(LigationMix)5μL、P MD18-TVector 1μL、Insert DNA 2μL、ddH2O 2μL,輕輕混勻,置于 PCR儀中16℃連接 4～5 h.

按照文獻(xiàn)[2]的方法,采用冷 CaCl2法制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞,將連接的產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)入Escherichia coliJM109,37℃培養(yǎng) 24～48 h轉(zhuǎn)化菌,以藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化的陽性菌.

1.2.5 菌落 PCR及 ITS測序

挑取白色陽性菌落劃線培養(yǎng),每個菌落劃一條線.待菌苔長出后用牙簽挑取少許菌,做菌落PCR.菌落 PCR反應(yīng)條件稍有變化,預(yù)變性溫度為 95℃,變性時間為 8 min.用凝膠電泳檢測菌落PCR產(chǎn)物,對轉(zhuǎn)入的目的片段的對應(yīng)菌落做穿刺培養(yǎng),將穿刺培養(yǎng)物送 Invitrogen(上海)公司測序.

1.2.6 DNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

運(yùn)用BLAST工具分析獲得的內(nèi)生真菌 ITS序列,在 GenBank中搜索相似序列,選取同源性較高的序列進(jìn)行比對.將相關(guān)序列用 DNAMan (version4.0)作比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定內(nèi)生真菌的分類地位.

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR獲得的 ITS產(chǎn)物

以JY2和 JY9的總DNA為模板,以 ITS4和ITS5為引物,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳,結(jié)果見圖 1.JY2的 ITS片段長度約為 570 bp,JY9的 ITS片段長度約為 560 bp.

圖 1 菌株JY2和 JY9的 rDNA-ITS序列擴(kuò)增結(jié)果

2.2 rDNA-ITS序列測序

經(jīng)載體連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌、篩選陽性轉(zhuǎn)化菌落后,對 JY2和 JY9這 2株金銀花內(nèi)生真菌的rDNA-ITS片段進(jìn)行測序.JY2的 ITS序列長度為570 bp.在 GeneBank中未發(fā)現(xiàn)有金銀花內(nèi)生真菌序列,故將此序列登錄在 GenBank中,登錄號為GU380354.JY9的 ITS序列共計 558 bp,在 Gen-Bank中的登錄號為 GU380355.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將 2株內(nèi)生真菌的 r DNA-ITS序列通過NCB I數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析,從中選取具有代表性的菌株,以 ITS序列同源性為基礎(chǔ),利用DNAMan軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并將兩株內(nèi)生真菌的測序結(jié)果用軟件與 GenBank中獲取的相似序列進(jìn)行比對分析.JY2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖 2.

由圖 2可以看出,JY2菌株序列與鐮刀菌屬的多條序列相似程度較高,同源性在 99%以上,與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致.因此,將該菌株鑒定為鐮刀菌屬 (Fusarium sp.).

JY9菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖 3.

從圖 3可以看出,JY9與所選相似序列均不在同一個分支上,同源性僅達(dá)到 14%,說明其 ITS變異較大,只能推測其可能為子囊菌門.筆者曾對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,鑒定為肉座菌目肉座菌科的赤霉屬.

3 討論

目前對真菌的分類鑒定主要采用兩種方法:形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定.傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察在早期真菌鑒定中發(fā)揮巨大的作用,但是由于該方法在一定程度上受人為因素和環(huán)境條件的干擾,不能充分反映物種的進(jìn)化關(guān)系,僅僅用形態(tài)學(xué)鑒定是有缺陷的.

近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,分子生物學(xué)技術(shù)在真菌學(xué)的鑒定中得到了廣泛而深入的應(yīng)用[3].真菌核糖體基因中位于 25S r DNA的 3′端與 18S rDNA的 5′端之間的 ITS序列和位于 25S rDNA的 5′端與 18S r DNA的 3′端之間的 ITS序列有不同的進(jìn)化程度,表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致、種間差異比較明顯,這一特點(diǎn)使得 ITS區(qū)段不僅適合于屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,而且非常適合于真菌物種的分子鑒定[4],尤其對一些不產(chǎn)孢、無法利用形態(tài)學(xué)鑒定的菌株進(jìn)行鑒定,ITS的應(yīng)用優(yōu)勢尤為突出.易曉華等[5]對除蟲菊 (Pyrethrum cinerariifolium)、王磊等[6]對白木香 (Aquilaria sinensis)、楊潤壓等[7]對南蛇藤 (Celastrus orbiculatus)以及郭尚彬等[8]對金錢松 (Pseudolarix kaem pferi)菌種的鑒定,都是基于 ITS序列分析進(jìn)行鑒定的成功應(yīng)用.

利用 PCR擴(kuò)增內(nèi)生真菌的 ITS序列,供試的rDNA-ITS序列通過與 GenBank數(shù)據(jù)庫中有關(guān)序列進(jìn)行BLAST比對,序列相似性≥99%,可以鑒別為相同種;序列相似性為 95%～99%,可以鑒別為相同屬;序列相似性≤95%,可以鑒別為相同科.根據(jù)其基因序列,能夠較為準(zhǔn)確地將真菌鑒定到屬及屬以上、種、亞種,甚至菌株的水平.本研究采用分子生物學(xué)手段擴(kuò)增真菌的核糖體 ITS片段,通過分析其 ITS序列,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,將菌株 JY2鑒定為鐮刀菌屬 (Fusarium sp.),將為下一步分析和利用菌株中的高效抑菌活性物質(zhì)提供幫助.JY9的分子鑒定結(jié)果同形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相差較大,與金銀花內(nèi)生菌的研究相對較少有關(guān),也可能是一種新發(fā)現(xiàn)的菌株,還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究確定.

鐮刀菌(Fusarium)真菌是最常見的植物病原菌以及植物內(nèi)生真菌,目前,在燈盞細(xì)辛(Erigeron breviscapus)[9]、苦楝 (M elia azeda rach)[10]、咖啡[11]等植物中均發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬的內(nèi)生菌,金銀花內(nèi)生真菌 JY2菌株也鑒定為鐮刀菌 (Fusarium),同國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者的相關(guān)研究結(jié)果一致.因此,鐮刀菌無論是作為植物病原菌還是具藥用價值的內(nèi)生菌,都具有重要的研究價值.

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[5] 易曉華,朱明旗,馮俊濤,等.1株具抑菌活性除蟲菊內(nèi)生真菌的菌種鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008, 36(8):165-169.

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ITS SEQUENCE IDENTIFICATION OF ENDOPHYTIC FUNGIW ITH H IGH ANTIBACTER IAL ACTIV ITY FROMFLOS LON ICERAE

L IJin,YI Yan-jie,SH I Yu,YUAN Yuan,L IJun-xia,ZHANG Hui-ru
(School of B ioengineering,Henan University of Technology,Zhengzhou450001,China)

The article deter mined and analyzed the ITS sequence inr DNA of two strains of high-antibacterialactivityendophytic fungi(JY2 and JY9)isolated from FlosLonicerae bymolecular biologicalmethod.The results show that the homology between JY2 andFusariumis higher than 99%,so that the JY2 belongs toFusarium;and JY9 has low homology with other fungi the similar sequences so that we can infer that JY9 possibly belongs toAscom ycota.But according to morphology,JY9 belongs toGibberella,which is different from the above result.

Flos Lonicerae;endophytic fungi;ITS sequence

TS201.3

B

1673-2383(2010)03-0050-04

2010-02-09

河南工業(yè)大學(xué)基金項(xiàng)目 (09XZZ048);引進(jìn)人才項(xiàng)目(150214)

李瑾(1985-),女,山東菏澤人,碩士研究生,主要從事中草藥內(nèi)生真菌抑菌活性的研究.

＊通信作者