柳 海，楊 宇，金 鳳 燮，魚 紅 閃

（大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

絞股藍(lán) ［Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Makino］，為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)用以治療咳嗽、痰喘、慢性氣管炎、傳染性肝炎等疾病。近代醫(yī)學(xué)研究表明，絞股藍(lán)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、呼吸及消化系統(tǒng)疾病均有防治作用［2］。

絞股藍(lán)中含有多種化學(xué)成分［3-4］，其中以絞股藍(lán)皂苷為主要的藥理活性成分。迄今發(fā)現(xiàn)的絞股藍(lán)皂苷達(dá)136種，它主要是由四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型絞股藍(lán)皂苷元與糖基組成［5］。在諸多的絞股藍(lán)皂苷中有絞股藍(lán)皂苷Ⅲ、Ⅳ等分別與人參皂苷Rb1、Rb3結(jié)構(gòu)完全相同。根據(jù)絞股藍(lán)皂苷與人參皂苷的苷元母環(huán)結(jié)構(gòu)相同的特點(diǎn)，可以利用生物酶對(duì)絞股藍(lán)皂苷上的糖基進(jìn)行改造，進(jìn)而制備人參皂苷。本實(shí)驗(yàn)室在前期的工作中篩選到這種生物酶，并對(duì)其反應(yīng)進(jìn)行了研究［6］。本文針對(duì)利用生物酶反應(yīng)制備的絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，制備得到單體化合物，并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物20g，實(shí)驗(yàn)室自制；人參皂苷Rd標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)室自制；薄層層析板Silica，德國Merck公司；硅膠，青島海洋化工廠；Waters 2695高效液相色譜儀，美國生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硅膠柱分離純化絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物

樣品膠的制備：準(zhǔn)確稱取一定量待分離的絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物，用5倍體積的氯仿甲醇溶液［V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1］在60 ℃水浴中完全溶解后，加入1.5 倍樣品質(zhì)量的硅膠，其目數(shù)是80～100目，攪拌均勻，繼續(xù)在水浴中加熱，直至溶劑揮發(fā)干燥后，顆粒均勻而不膩手，即成樣品膠。

裝柱：裝柱時(shí)先用一小塊脫脂棉堵住柱底，然后取適量300～400目的硅膠緩慢倒入柱中，輕輕敲打柱子兩側(cè)，至硅膠界面不再下降為止；將制備好的樣品膠倒入柱中后，利用真空泵抽實(shí)，最后在頂部蓋上一層約5mm 厚的脫脂棉。

梯度洗脫：硅膠柱裝好后，先用氯仿通柱；再依次按V（氯仿）∶V（甲醇）=9∶1、8∶2、7∶3的梯度洗脫樣品，利用薄層層析法對(duì)收集的樣品進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，分部收集洗脫液。

1.2.2 薄層層析法（TLC）檢測(cè)絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物的分離情況

用微量點(diǎn)樣器吸取分部收集的洗脫液，點(diǎn)樣于薄層層析板上，點(diǎn)樣量為10μL，利用展開劑展開。展開劑的配比為V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5，顯色劑為10%硫酸溶液，121 ℃顯色10min。

1.2.3 高效液相色譜法測(cè)定分離單體的純度

利用高效液相色譜儀對(duì)分離得到的單體皂苷進(jìn)行純度的檢測(cè)及皂苷種類的初步鑒定。儀器，Waters2695；色譜柱，Hypersil ODS2（4.6 mm×250mm，5μm）不銹鋼填充柱；進(jìn)樣量，10μL；體積流量，1.0 mL/min；柱溫，35 ℃；流動(dòng)相，乙腈（A）-水（B）梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)，203nm；洗脫程序如表1所示。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 The developing procedure of HPLC flowing form

2 結(jié)果與討論

2.1 硅膠柱分離絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物

準(zhǔn)確稱取絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物20g，加入甲醇和氯仿各50 mL 充分溶解后，加入30g 80～100目硅膠制成樣品膠。取300～400 目硅膠300g作為分離膠裝柱，加入80～100目硅膠15g作為緩沖區(qū)域，填加樣品膠，蓋上脫脂棉，抽實(shí)。首先用純氯仿通柱，再依次采用氯仿-甲醇洗脫液［V（氯仿）∶V（甲醇）=9∶1、8∶2、7∶3］進(jìn)行梯度洗脫，每次洗脫200mL，采用TLC法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，直至這一梯度沒有物質(zhì)被洗脫出來時(shí)更換下一個(gè)梯度。分部收集洗脫液。TLC 法跟蹤檢測(cè)如圖1所示。

圖1 硅膠柱分離TLC圖譜Fig.1 Separation by silica gel column

由圖1可以看出，絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物中主要含有3種物質(zhì)。氯仿通柱后先用氯仿-甲醇洗脫液進(jìn)行洗脫［V（氯仿）∶V（甲醇）=9∶1］，收集到1～6號(hào)樣品，由圖1可知收集到的樣品中皂苷含量極少；更換洗脫液的洗脫梯度［V（氯仿）∶V（甲醇）=8∶2］后，有少量主要酶解產(chǎn)物被洗出，且隨著洗脫的進(jìn)行，收集到的樣品中產(chǎn)物2的含量逐漸增大，在19號(hào)樣品中產(chǎn)物2的量達(dá)到最大值，隨后其含量又逐漸減少；收集到24號(hào)樣品時(shí)更換了洗脫梯度［V（氯仿）∶V（甲醇）=7∶3］，收集到的樣品25～31中仍有少量產(chǎn)物2，可能是上一梯度洗脫不夠充分所致。由圖1可以清晰地看出分部收集的樣品中13～24號(hào)樣品所含的產(chǎn)物2較純，因此將這部分樣品一起收集。將收集到的產(chǎn)物2的樣品液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得干品5.06g，其得率為25.3%。

2.2 酶解產(chǎn)物的純度檢測(cè)及物質(zhì)的初步鑒定

將分離純化得到的酶解產(chǎn)物單體及人參皂苷Rd的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

圖2 絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物分離鑒定HPLC圖譜Fig.2 HPLC of gypenoside hydrolysate and its purification product

由圖2 可見，絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物中含有5～6種組分，樣品混雜，其中保留時(shí)間在39.025min的物質(zhì)含量相對(duì)較高。該樣品經(jīng)硅膠柱梯度洗脫，純化得到的樣品HPLC 圖譜（c）中，保留時(shí)間在39.003min的物質(zhì)純化效果好，其他的雜質(zhì)峰很少。

圖2（a）是人參皂苷Rd的標(biāo)準(zhǔn)品，其HPLC中的保留時(shí)間為39.038min，而圖2（b）、2（c）中在相應(yīng)保留時(shí)間處也有峰型存在。尤其是圖2（a）和2（c）比較，兩圖中的出峰保留時(shí)間分別是39.038和39.003min，同時(shí)絞股藍(lán)皂苷與人參皂苷的苷元母環(huán)都是四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型結(jié)構(gòu)，根據(jù)這些相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，初步鑒定絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物分離純化樣品可能為人參皂苷Rd。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)絞股藍(lán)皂苷酶解產(chǎn)物的分離純化，得到了純度較高的單體化合物。該化合物經(jīng)HPLC檢測(cè)，與人參皂苷Rd比較發(fā)現(xiàn)兩者的出峰時(shí)間相同；同時(shí)，由于二者結(jié)構(gòu)相似，初步確定產(chǎn)物為人參皂苷Rd，為利用絞股藍(lán)總皂苷為底物，采用生物酶法制備人參皂苷以及相關(guān)的開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。