王 珊，孫 鳳 麟，孫 玉 梅，陳 莉

（大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

脂肪酶是一類在油-水界面上催化天然油脂（甘油三酯）降解為甘油和游離脂肪酸的酶。近年來它在食品生產(chǎn)、皮革加工、醫(yī)藥衛(wèi)生、洗滌工業(yè)等方面都有著廣泛的應(yīng)用，已成為工業(yè)酶制劑中重要的生物催化劑之一［1-3］。

生物柴油是可再生并能生物降解的良好石油代替能源。生物法制備生物柴油較化學(xué)法具有反應(yīng)條件溫和、醇用量小、產(chǎn)物易收集、對環(huán)境污染小等優(yōu)點，具有高催化效率和經(jīng)濟(jì)性［4］。在生物法制備生物柴油的反應(yīng)體系中，減少甲醇對生物催化劑的毒害作用是提高生產(chǎn)效率的關(guān)鍵，為此，人們采取措施減少甲醇對生物催化劑的毒害作用，并進(jìn)行了相關(guān)研究［5］。但在生物柴油催化劑的甲醇耐受性方面的研究，到目前為止，卻還沒有相關(guān)詳細(xì)的報道。本研究通過維多利亞藍(lán)指示劑透明圈篩選法，從土樣中篩選到1株產(chǎn)脂肪酶活性較高的菌株FM-1，并對其進(jìn)行了耐甲醇馴化。

1 實驗

1.1 土樣

土壤，大連工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)含油豐富的土壤。

1.2 培養(yǎng)基及組成

富集培養(yǎng)基（g/L）：（NH4）2SO40.1，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，NaCl 0.5，吐溫80 0.1，豆油2.0，自然pH 值，于1.03×105Pa滅菌30min［6］。

平板初篩培養(yǎng)基（g/L）：NaNO30.3，K2HPO40.1，KCl 0.05，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，吐溫80 0.1，大豆油2.0，瓊脂2.0，維多利亞藍(lán)1 mg，用Na2CO3調(diào)pH 至8.0，于1.03×105Pa下滅菌30min。

復(fù)篩培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，K2HPO40.1，KCl 0.05，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 0.05，大豆油2.0，吐溫80 0.1，自然pH 值，于1.03×105Pa下滅菌30min［6］。

馴化培養(yǎng)基：在滅菌后復(fù)篩培養(yǎng)基中加入一定量的無菌甲醇。

斜面保藏培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基。

1.3 脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

1.3.1 菌株的活化

取冰箱保存的菌株，接種于察氏培養(yǎng)基，于30 ℃活化培養(yǎng)48h。

1.3.2 種子液的制備向100mL 富集培養(yǎng)基中接入2 環(huán)菌絲，于28 ℃、130r/min搖床培養(yǎng)12h。

1.3.3 土樣分離與富集培養(yǎng)

取1g含油豐富的土壤和9mL無菌生理鹽水于試管中振蕩混勻，靜置12h，按2%接種量接于50mL的富集培養(yǎng)基中，于28 ℃、130r/min 搖床培養(yǎng)4d。按10%接種量重復(fù)富集培養(yǎng)3次。

1.3.4 初 篩

將富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水稀釋至合適的濃度，選10-5、10-6、10-73 個稀釋度，每個稀釋度取0.1mL菌液涂布于初篩平板上，于28 ℃靜置培養(yǎng)72h。產(chǎn)脂肪酶的微生物菌落周圍產(chǎn)生透明圈［7］，分離出透明圈與菌落直徑的比值較大的菌株即為脂肪酶活性較高的菌株，經(jīng)3次劃線分離、純化獲得純菌落。

生命周期費(fèi)用是將項目的初投資、項目設(shè)計壽命內(nèi)每一年的運(yùn)行費(fèi)，按照折現(xiàn)率折算成項目開始時的資金現(xiàn)值。生命周期費(fèi)用的大小綜合反映了項目初投資以及每年運(yùn)行費(fèi)的情況，生命周期費(fèi)用越小，項目的經(jīng)濟(jì)性越好[10]。生命周期費(fèi)用的計算如下：

1.3.5 復(fù) 篩

將初篩的菌株接種于100 mL 復(fù)篩培養(yǎng)基中，于28 ℃、130r/min搖床培養(yǎng)60h，測初篩菌株細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外的脂肪酶活性，選出產(chǎn)脂肪酶能力較高的菌株。

1.4 菌株FM-1的耐甲醇馴化

1.4.1 原始菌株FM-1的耐甲醇性

將5mL菌株FM-1種子液接入100mL甲醇質(zhì)量濃度分別為1、3、5、7、9、11mg/L的馴化培養(yǎng)基中，于28℃、130r/min搖床培養(yǎng)60h，設(shè)原始菌的酶活為100%，測菌體中脂肪酶的相對活性。

1.4.2 菌株FM-1的耐甲醇馴化

馴化培養(yǎng)基中接入2～3 環(huán)菌株FM-1，于28 ℃、130r/min搖床培養(yǎng)60h，在同一甲醇質(zhì)量濃度下馴化至脂肪酶活性穩(wěn)定。菌種經(jīng)過若干代馴化后，逐漸適應(yīng)含有甲醇的環(huán)境，斜面保藏。

1.5 脂肪酶活力測定

脂肪酶活力定義：在最適反應(yīng)條件下，以每分鐘脂肪酶催化橄欖油水解產(chǎn)生1μmol脂肪酸的酶量為1個酶活單位（U）。

用銅皂比色法［8］測定脂肪酸量，每個樣品測3組平行樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

從含油土樣中分離出34株脂肪酶產(chǎn)生菌，在維多利亞藍(lán)培養(yǎng)基上初篩出透明圈與菌落直徑比值較大的6株菌。經(jīng)復(fù)篩測得脂肪酶活力見圖1。

圖1 脂肪酶產(chǎn)生菌復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Rescreen results of strains producing lipase

如圖1所示，6 株脂肪酶產(chǎn)生菌的細(xì)胞內(nèi)脂肪酶活力均高于發(fā)酵液中脂肪酶（即胞外脂肪酶）活力，均為胞內(nèi)脂肪酶產(chǎn)生菌。在6株脂肪酶產(chǎn)生菌中，菌株FM-1的胞內(nèi)酶活力明顯高于其他菌株；大部分菌株在條件2下超聲破碎細(xì)胞后測得的胞內(nèi)酶活較條件1 高。因此，確定在條件2下超聲破碎菌株FM-1細(xì)胞較好。

2.2 菌株FM-1的菌落形態(tài)

將優(yōu)勢菌株FM-1接種于平板中央，于30 ℃倒置培養(yǎng)4～7d。

由圖2可知，菌落形成初期為白色，菌絲體生長迅速，很快鋪蓋平皿表面，菌落周圍產(chǎn)生透明圈，說明產(chǎn)生脂肪酶。

2.3 菌株FM-1的耐甲醇馴化

2.3.1 原始菌株FM-1的耐甲醇性

將菌株FM-1接入不同甲醇質(zhì)量濃度的馴化培養(yǎng)基中，測得胞內(nèi)脂肪酶相對活力如表1所示，由表1可知，在不同甲醇質(zhì)量濃度的馴化培養(yǎng)基中，菌株FM-1的胞內(nèi)脂肪酶相對活力隨培養(yǎng)基中甲醇質(zhì)量濃度的升高而下降，表現(xiàn)出甲醇對胞內(nèi)脂肪酶的抑制作用。

圖2 菌株FM-1的平板菌落Fig.2 Colony morphology of strain FM-1on agar plate

表1 菌株FM-1在馴化培養(yǎng)基中的相對酶活Tab.1 Lipase relative activity of strain FM-1 in the acclimate media

2.3.2 菌株FM-1的耐甲醇馴化

菌株FM-1在不同甲醇質(zhì)量濃度的馴化培養(yǎng)基中的耐甲醇馴化結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株FM-1在不同質(zhì)量濃度甲醇培養(yǎng)基中的馴化結(jié)果Fig.3 Acclimation result of strain FM-1in media containing methanol at various concentration

由圖3可知，菌株FM-1經(jīng)反復(fù)馴化后，其對不同質(zhì)量濃度甲醇的耐受性均有提高。在甲醇質(zhì)量濃度為1 mg/L 的馴化培養(yǎng)基中馴化后，脂肪酶活性在每批次馴化中無明顯提高，說明甲醇質(zhì)量濃度為1mg/L的馴化培養(yǎng)基對菌體生長的影響和胞內(nèi)脂肪酶的馴化的作用不明顯。在甲醇質(zhì)量濃度為3～7mg/L的馴化培養(yǎng)基中馴化后，菌株FM-1長勢良好，胞內(nèi)脂肪酶活力由65%～80%提高到82%～95%。在甲醇質(zhì)量濃度為9mg/L的馴化培養(yǎng)基中馴化后，胞內(nèi)脂肪酶活性沒有顯著提高。在甲醇質(zhì)量濃度為11 mg/L 的馴化培養(yǎng)基中，菌株FM-1的胞內(nèi)脂肪酶活力最低，經(jīng)馴化后，酶活性有一定提高，其胞內(nèi)脂肪酶相對活力為35%，較原始菌株有顯著提高?？梢?，在一定甲醇質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，培養(yǎng)基中加入甲醇對提高細(xì)胞內(nèi)酶的甲醇耐受性有一定的馴化作用，但甲醇質(zhì)量濃度過高，不但無明顯馴化作用，還會造成對細(xì)胞內(nèi)酶的較大抑制作用，因此，不適合采用較高濃度甲醇的培養(yǎng)基進(jìn)行耐甲醇馴化。

3 結(jié)論

在酶法制備生物柴油的反應(yīng)體系中，減少甲醇對生物催化劑的毒害作用，是提高生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。本實驗從含油土樣中對34株脂肪酶產(chǎn)生菌進(jìn)行了分離，篩選出產(chǎn)脂肪酶活性較高的菌株；通過菌株的耐甲醇馴化，使活細(xì)胞對甲醇毒害的耐受性得以提高。研究表明，篩選出的產(chǎn)脂肪酶活性較高的菌株FM-1 的胞內(nèi)脂肪酶活力為132U/g cell；通過反復(fù)馴化培養(yǎng)將菌株FM-1馴化成耐甲醇的優(yōu)良菌株，在甲醇質(zhì)量濃度為11mg/L的培養(yǎng)基中其脂肪酶相對活力為35%。