陳安琪，劉學(xué)杰，崔曉棟，劉江月，張代娟，郭軍堂

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)部，山東濰坊 261053;2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊 261041)

β-synuclein蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

陳安琪1，劉學(xué)杰2，崔曉棟1，劉江月1，張代娟1，郭軍堂1

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)部，山東濰坊 261053;2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊 261041)

目的 構(gòu)建人β-synuclein基因的原核表達(dá)載體，分析其在大腸桿菌中的表達(dá)。方法 從人腦組織中提取總RNA，用RT-PCR方法獲得人β-synuclein基因，克隆至pCUm-T載體中，PCR篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。將酶切后的目的片段克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果 RT-PCR擴(kuò)增出人β-synuclein基因，將其亞克隆至pGEX-6P-1構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒，并在BL21中表達(dá)了β-synuclein蛋白。結(jié)論 成功構(gòu)建人 β-synuclein的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)了人 βsynuclein融合蛋白，為進(jìn)一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

β-synuclein;帕金森病;載體構(gòu)建

β-synuclein蛋白由 l34個(gè)氨基酸組成，是synucleins蛋白家族成員之一。β-synuclein與 αsynuclein是同族異構(gòu)體，兩者在結(jié)構(gòu)上有78%的同源性，但缺失α-synuclein蛋白中部71－82位11個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的 NAC片段［1］。研究發(fā)現(xiàn) β-synuclein能夠 抑 制 α-synuclein 聚 集［2］，明 顯 的 改 善 αsynuclein轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)的動(dòng)力缺乏，有抑制細(xì)胞凋亡的作用［3］，對(duì)帕金森病(Parkinson's disease，PD)具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，但具體的機(jī)制尚不清楚。研究 β-synuclein與其他蛋白之間的相互作用，對(duì)于闡述 β-synuclein的神經(jīng)保護(hù)作用具有重要的意義，但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于這方面的研究報(bào)道甚少。本研究原核細(xì)胞表達(dá)帶有 GST標(biāo)簽的βsynuclein融合蛋白，為通過(guò)GST pull down等方法研究β-synuclein與其他蛋白之間相互作用的研究打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料

腦組織來(lái)源于流產(chǎn)胎兒腦組織;質(zhì)粒pGEX-6P-1和大腸桿菌 BL21、DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存;Trizol、T4DNA連接酶及Pyrobest DNA polymerase購(gòu)自寶生物工程有限公司;BamHI和 XhoI內(nèi)切酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA marker-D、蛋白 marker及 pCUm-T載體購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR:用Trizol從腦組織中抽提總 RNA，取1 μg RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，采用 AMV First Strand cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行 RT反應(yīng)。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.2 β-synuclein基因的克隆與鑒定:根據(jù)Genbank(ID6620)報(bào)道序列設(shè)計(jì)引物，上游引物:5′-GGATCCAGGATGGACGTGTT CATG-3′(含 BamHI酶切位 點(diǎn))，下 游 引 物:5′-CTCGAGCCTACGCCTCTGGC TCATACT-3′(含 XhoI酶切位點(diǎn))。采用 Pyrobest DNA polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 2 min，循環(huán)數(shù)為 30，94℃變性 40 s，50℃退火 40 s，72℃延伸90 s，循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸10 min。

1.2.3 pCUm-T-β-synuclein的構(gòu)建:PCR產(chǎn)物加“A”后與 pCUm-T載體4℃進(jìn)行連接。取5 μL連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)菌，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色克隆，少量提取質(zhì)粒，用BamHI和XhoI雙酶切和PCR反應(yīng)初步鑒定陽(yáng)性克隆。將酶切鑒定和PCR反應(yīng)正確的細(xì)菌克隆送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建:測(cè)序正確的質(zhì)粒pCUm-T-β-synuclein用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切，純化回收 419 bp大小的目的片段，與 BamHI和XhoI雙酶切的質(zhì)粒 pGEX-6P-1 4℃反應(yīng)16 h，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)菌。少量提取質(zhì)粒，用BamHI和XhoI雙酶切和PCR反應(yīng)鑒定陽(yáng)性細(xì)菌克隆，獲得pGEX-6P-β-synuclein原核表達(dá)載體。

1.2.5 原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):將鑒定正確的菌株常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(A600為0.5～1.0)，IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導(dǎo)6 h收獲菌體，PBS重懸后加入溶菌酶(終濃度 1 mg/mL)，冰上放置30 min后，將0.2%Triton X-100注入裂解物中，劇烈震蕩混勻后加入DNase和 RNase(終濃度 5 μg/mL)。震蕩 10 min后，4℃ 3000 r/min離心 30 min，提取上清并加入 DTT至終濃度1 mmol/L，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。使用10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳后。

1.2.6 考馬斯亮藍(lán)R250染色:將凝膠放至五倍體積的考馬斯亮藍(lán)R250染色液中，搖床上室溫緩慢旋轉(zhuǎn)3～4 h。換掉染液，用無(wú)染料的甲醇/醋酸溶液浸泡凝膠，緩慢搖動(dòng)4～8 h脫色，其間換3～4次溶液。繼續(xù)脫色24 h后，用掃描儀掃描凝膠圖像。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后得到一條約420 bp的特異條帶，與目的基因βsynuclein的大小一致(圖1)。

1.PCR產(chǎn)物;M.DNA marker-D圖1 RT-PCR結(jié)果1.PCR products;M.DNA marker-DFig.1 Electrophoresis results of RT-PCR

2.2 pCUm-T-β-synuclein的構(gòu)建與鑒定

挑取白色克隆，小提質(zhì)粒后進(jìn)行 PCR、酶切和測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI和XhoI酶切后得到預(yù)期的約420 bp和2800 bp大小的兩條片段，PCR擴(kuò)增得到一條約 420 bp大小的條帶(圖2)。對(duì)PCR和酶切鑒定的克隆送上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與 Genbank序列(ID6620)進(jìn)行 Blast序列比對(duì)，堿基序列完全一致(結(jié)果略)。證實(shí)目的基因已經(jīng)克隆到pCUm-T載體中。

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

pGEX-6P-β-synuclein經(jīng) PCR擴(kuò)增得到一條約420 bp大小的條帶(圖3)。證實(shí)目的基因已經(jīng)克隆到pGEX-6P-1原核表達(dá)載體中。

2.4 β-synuclein原核蛋白的表達(dá)

將 pGEX-6P-β-synuclein轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，收集菌體進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，考馬斯亮蘭R-250染色后在預(yù)期位置約40×103處有明顯的蛋白條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌在相應(yīng)位置則沒(méi)有相應(yīng)的蛋白條帶(圖4)，說(shuō)明該蛋白在大腸桿菌BL21中成功表達(dá)。

1.PCR products;2.BamHI和XhoI酶切結(jié)果;M.DNA marker-D圖2 重組 pCUm-T-β-synuclein的鑒定1.PCR products;2.pCUm-T-β-synucleindigestedbyBamHIand XhoI;M.DNA marker-DFig.2 Identification of pCUm-T-β-synuclein

M.DNA marker-D;1.PCR products圖3 重組 pGEX-6P-β-synuclein PCR鑒定結(jié)果M.DNA marker-D;1.PCR productsFig.3 Identification of pGEX-6P-β-synuclein by PCR

1.pGEX-6P-β-synuclein 經(jīng)誘導(dǎo);2.pGEX-6P-β-synuclein 未經(jīng)誘導(dǎo);M.蛋白Marker圖4 重組蛋白β-synuclein的鑒定1.Induced pGEX-6P-β-synuclein; 2.Non-induced pGEX-6P-βsynuclein;M.Protein markerFig.4 Expression of β-synuclein analyzed by SDS-PAGE

3 討論

β-synuclein沒(méi)有聚集形成原纖維的傾向，不具有神經(jīng)細(xì)胞毒性作用［4］，能夠明顯的改善由 αsynuclein聚集引起的神經(jīng)元變性，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用［5］。β-synuclein對(duì)PD的這種神經(jīng)保護(hù)作用可能與以下因素有關(guān):(1)β-synuclein具有抗氧化作用，能夠抑制α-synuclein依賴(lài)的氧化應(yīng)激［6］;(2)β-synuclein能夠抑制 α-synuclein 的表達(dá)，從而抑制α-synuclein的神經(jīng)毒性作用［7］。

但具體的保護(hù)機(jī)制尚未完全明了，這也是目前應(yīng)用β-synuclein進(jìn)行PD治療的主要障礙。

GST pull down是一種經(jīng)典的用來(lái)研究蛋白相互作用的有效方法，為了發(fā)現(xiàn)能夠與β-synuclein相互作用的蛋白，我們采用RT-PCR法從胚胎腦組織中克隆人β-synuclein基因，并將其克隆至谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達(dá)載體pGEX-6P-1中?；蚪?jīng)測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增的目的序列與所需的人β-synuclein基因序列一致，適用于后續(xù)的基因表達(dá)。我們按照IPTG終濃度1 mmol/L，培養(yǎng)6 h進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)、收獲與檢測(cè)，在蛋白電泳圖中可見(jiàn)約40×103的新增蛋白條帶，說(shuō)明我們已經(jīng)成功在大腸桿菌中誘導(dǎo)β-synuclein融合蛋白，提取該蛋白的方法可行，為下一步谷胱甘肽親和柱純化β-synuclein融合蛋白、GST pull down捕獲與β-synuclein作用的蛋白及研究其在PD發(fā)病機(jī)制中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

［1］ Goedert M.Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases［J］.Nat Rev Neurosci，2001，2(7):492－501.

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Construction of Prokaryotic Expression Vector of β-Synuclein and Expression in E.coli BL21

CHEN An-qi1，LIU Xue-jie2，CUI Xiao-dong1，LIU Jiang-yue1，ZHANG Dai-juan1，GUO Jun-tang1
(1.Department of Basic Medicine;2.Affiliated Hospital，Weifang Medical University，Shandong Weifang 261053，China)

ObjectiveTo construct a prokaryotic expression vector of β-synuclein and analyze its expression in E.coli BL21.MethodsTotal RNA was isolated from human fetal brain tissue.The full-length human β-synuclein cDNA was obtained by RT-PCR and then inserted into pCUm-T vector for sequencing.The target gene fragment was subcloned into pGEX-6P-1 vector correctly and then transformed into E.coli BL21.The expression of β-synuclein was induced with IPTG，and analyzed by SDS-PAGE.Resultsβ-synuclein was amplified by RT-PCR and subcloned into pGEX-6P-1 properly.The recombinant fusion protein was expressed in E.coli BL21.ConclusionThe prokaryotic expression vector of β-synuclein has been successfully constructed and expressed in E.coli BL21，providing a foundation for the further study of β-synuclein in Parkinson's disease.

β-synuclein;Parkinson's disease;Gene expression;E.coli

R742

A

1005-4847(2010)06-0495-03

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.06.010

2010-03-23

山東省衛(wèi)生廳青年基金(2007QW007);濰坊醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金。

陳安琪(1981－)，講師，研究方向?yàn)榕两鹕“l(fā)病機(jī)制。

郭軍堂(1973－)，男，副教授，研究方向:帕金森病發(fā)病機(jī)制。E-mail:guojuntang@sohu.com