朱 亮，蔡月琴，屠 玨，應(yīng)華忠，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

磁珠富集法篩選實(shí)驗(yàn)豚鼠微衛(wèi)星分子標(biāo)記

朱 亮，蔡月琴，屠 玨，應(yīng)華忠，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

目的 直接從實(shí)驗(yàn)豚鼠基因組DNA中篩選獲得微衛(wèi)星分子標(biāo)記。方法 應(yīng)用磁珠和生物素標(biāo)記的微衛(wèi)星探針與豚鼠基因組酶切片段雜交，捕獲200～1000 bp含有微衛(wèi)星序列的DNA片段，連接到pMD－18V載體中，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中構(gòu)建富集微衛(wèi)星序列的小片段插入文庫。然后用PCR法進(jìn)行篩選。結(jié)果 從約2000個(gè)轉(zhuǎn)化子中獲得240個(gè)陽性克隆。對其中98個(gè)進(jìn)行了測序，并成功設(shè)計(jì)豚鼠微衛(wèi)星引物17對。結(jié)論 經(jīng)過優(yōu)化的磁珠富集法能夠穩(wěn)定、高效地獲得豚鼠微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究獲得的微衛(wèi)星位點(diǎn)將成為豚鼠遺傳學(xué)研究的有力工具。

豚鼠;磁珠富集法;微衛(wèi)星

豚鼠是一種具有特殊的生物學(xué)特性和生理解剖特點(diǎn)的動(dòng)物。該物種易被致敏，體內(nèi)血清補(bǔ)體含量在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中最高，皮膚對毒物刺激反應(yīng)靈敏且接近人類，體內(nèi)不能合成維生素C，耳殼大且聽力敏銳，因而一直被大量應(yīng)用于過敏性哮喘研究、免疫學(xué)研究中補(bǔ)體的獲得、局部皮膚刺激試驗(yàn)、試驗(yàn)性壞血病的研究以及耳科學(xué)的研究［1］。另外，豚鼠個(gè)體小，性情溫順，容易飼養(yǎng)和抓取，這些特點(diǎn)都使其成為一種被廣泛使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)是指以幾個(gè)核苷酸(一般為1～6個(gè))多次重復(fù)組成的串聯(lián)序列。由于高度可變區(qū)核心序列重復(fù)數(shù)目的不同，產(chǎn)生了DNA的多態(tài)性［2］，又被稱為簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSR)，其長度大多在100 bp以內(nèi)。

小鼠、大鼠、沙鼠、家兔、犬、豬和獼猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微衛(wèi)星標(biāo)記都有專門的報(bào)導(dǎo)并且被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀位點(diǎn)定位、標(biāo)記輔助選擇、遺傳多樣性評估和遺傳監(jiān)測等領(lǐng)域，推動(dòng)了人類疾病動(dòng)物模型建立、功能基因定位和克隆、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系保持和新品系培育等研究工作的進(jìn)步［3－8］。豚鼠在遺傳背景上與大小鼠、家兔等物種差別比較大［9，10］，無法借鑒這些物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。

本研究從豚鼠基因組中分離篩選出17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立豚鼠微衛(wèi)星文庫，為深入研究豚鼠遺傳學(xué)特征和功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑和儀器

本研究使用的Dunkin Hartley種實(shí)驗(yàn)豚鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)豚鼠生產(chǎn)基地提供［SCXK(浙)2008－0037］。研究使用的主要試劑有:Taq DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 Sau3AⅠ、DL2000 DNA Marker、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、pMD18－T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(AXYGEN)購自杭州曉逸科技有限公司。研究使用的主要儀器有:紫外分光光度計(jì)(Thermo);PTC－200 PCR 擴(kuò)增儀(Bio－rad);恒溫混勻器 Thermomixer comfort 5355(Eppendorf);水平電泳系統(tǒng)(GE);凝膠成像系統(tǒng)(UVP)。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠基因組DNA的提取和酶切:采集豚鼠肌肉樣品2 g，剪碎放入1.5mL離心管，加入370mL TNE 緩沖液、100 μL 10%SDS、10 μL 的 10mg/mL蛋白酶K和20 μL的1 mol/L DTT?；靹蚝?，置于56℃消化過夜。使用酚－氯仿－異戊醇法提取基因組DNA［11］。無水乙醇沉淀，TE緩沖液溶解后用紫外分光光度計(jì)測定濃度和純度。用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下200～1000 bp片段，用試劑盒(Axygen)回收備用。

1.2.2 基因組片段同接頭的連接

1.2.2.1 接頭的制備:寡核苷酸鏈A(GGCCAGAGA CCCCAAGCTTCG)和B(CCGGTCTCTGGGGTTCGAA GCCTAG－PO4)由上海生工生物工程公司合成。將A、B鏈配成200 pmol/μL溶液，等比混合使終濃度為100 pmol/μL。將混合液升溫至80℃變性10 min，室溫冷卻1 h，以形成帶有限制性酶切位點(diǎn)(Sau3A I)的雙鏈接頭。最終形成的接頭為:

A.GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG

B.CCGGTCTCTGGGGTTCGAAGCCTAG－PO4

1.2.2.2 片段同接頭的連接:取經(jīng)過回收純化的基因組DNA酶切片段和合成好的接頭進(jìn)行連接，連接體系 50 μL［DNA 1.5 μg;接頭 (10 μmol/L)5 μL;10× T4 DNA Buffer 10μL;T4 DNA Ligation 3 μL;ddH2O補(bǔ)足］。16℃連接5 h，連接結(jié)束后，升溫至65℃滅活10 min。以此連接產(chǎn)物為模板，寡核苷酸鏈A為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50 μL(模板DNA 100 ng，10mmol/L Tris－HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，150 μmol/L dNTP，0.3 μmol/L 寡核苷酸鏈A，1.25單位的TaKaRa ExTaq DNA聚合酶)，反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性4 min;94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 90 s，共30次循環(huán);72℃延伸 10 min。產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，如果接頭與割膠回收的DNA片段成功連接，則PCR產(chǎn)物將在瓊脂糖凝膠上產(chǎn)生約200～1000 bp的條帶。PCR產(chǎn)物用回收試劑盒(Axygen)純化備用。

1.2.3 雜交及磁珠捕獲重復(fù)片段

1.2.3.1 探針的合成:根據(jù) Genbank資料設(shè)計(jì)(AC)12、(AG)12和(AAC)8三個(gè)探針，由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3.2 雜交:雜交體系為100 μL(PCR富集的連接產(chǎn)物800 ng左右;探針 0.1 μmol/L;12×SSC 50 μL;ddH2O)，95℃變性 30 min，然后轉(zhuǎn)到 1.5mL 離心管中雜交5～6 h。各探針的雜交溫度如下:(AC)12和 (AG)12為70℃，(AAC)8為60℃。

1.2.3.3 磁珠的準(zhǔn)備:將10 mg/mL的磁珠(Roche)在包裝瓶中混勻后取30 μL于1.5mL離心管中，加入 1× W/B buffer(10mmol/L Tris－HCl，1mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl)300 μL 緩慢沖冼，用自備的磁鐵吸附管壁約1 min，分離磁珠與漂洗液，棄漂洗液。重復(fù)上述步驟2次。最后加入200 μL 1×W/B buffer備用。

1.2.3.4 片段捕獲:將100 μL雜交液加至已準(zhǔn)備好的磁珠混合液中，43℃溫浴30 min，期間不斷振蕩，防止磁珠沉淀。然后加入 200 μL 2×SSC，0.1%SDS的溶液漂洗兩次，每次5 min;加入200 μL 1×SSC，0.1%SDS的溶液在 45℃漂洗兩次，每次5 min;加入 200 μL 1×SSC和 0.1%SDS的溶液，并于60℃漂洗兩次，每次5 min。最后一次加入60 μL TE與磁珠混勻后于95℃變性30 min后，迅速用磁鐵吸附管壁，并將含有捕獲片段的TE移至新的1.5mL離心管備用。

以含有捕獲片段的TE作為模板，再次用PCR檢測生物素標(biāo)記的探針和磁珠是否捕獲了含有微衛(wèi)星的目的片段(反應(yīng)體系及條件同上)。PCR產(chǎn)物割膠回收純化，以去除多余的引物和沒有參加反應(yīng)的dNTP，用紫外分光光度計(jì)檢測濃度，備用。

1.2.4 連接轉(zhuǎn)化和篩選鑒定:取PCR純化產(chǎn)物與pMD－18T載體連接，用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素、X－gal和IPTG的 LB平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。挑選白色菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37℃250 r/min振蕩培養(yǎng)4 h。取振蕩培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行PCR 檢測，10 μL 體系(菌液 1 μL，2mmol/L Tris－HCl，10mmol/L KCl，0.4mmol/L MgCl2，30 μmol/L dNTP，0.03 μmol/L 寡核苷酸 A 鏈，0.03 μmol/L 探針，0.25單位的TaKaRa ExTaq DNA聚合酶)。PCR產(chǎn)物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄。

經(jīng)鑒定為陽性克隆的菌液經(jīng)再次振蕩培養(yǎng)后送送交上海英駿生物技術(shù)有限公司。用通用引物(M13+/M13－)進(jìn)行測序。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)與檢測

1.2.5.1 引物設(shè)計(jì):挑選含有微衛(wèi)星片段的序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Permier 5.0設(shè)計(jì)引物并送上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2.5.2 引物性能檢測:通過PCR反應(yīng)，檢測設(shè)計(jì)合成引物在擴(kuò)增過程中的穩(wěn)定性和特異性。反應(yīng)體系為 10 μL(模板 DNA 50 ng，10mmol/L Tris－HCl，50mmol/L KCl，2.0mmol/L MgCl2，150 μmol/L dNTP，上、下游引物各 1 μmol/L，0.5 單位的 TaKaRa Taq DNA聚合酶)。反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性4 min;94℃ 30 s，各引物適宜退火溫度 30 s，72℃ 30 s，共30次循環(huán);72℃延伸10 min。

將上述擴(kuò)增所得的DNA片段在1.5% 的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 酶切及加接頭擴(kuò)增結(jié)果

選用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ對豚鼠基因組DNA進(jìn)行酶切，結(jié)果表明，37℃ 5 h的酶切反應(yīng)獲得了理想的效果(圖1)。接頭連接后PCR反應(yīng)得到的片段長度主要集中在200～1000 bp范圍內(nèi)(圖2)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 豚鼠基因組DNA提取結(jié)果和酶切結(jié)果圖Fig.1 Profile of the guinea pig genomic DNA and digested DNA

圖2 PCR檢測接頭連接的DNA的電泳圖譜Fig.2 Profile of the PCR testing of ligation success

2.2 磁珠富集及克隆測序結(jié)果

如果捕獲成功，則PCR產(chǎn)物將在瓊脂糖凝膠上產(chǎn)生約200～1000 bp的條帶［12］。圖3所示的結(jié)果，表明實(shí)驗(yàn)中磁珠富集效果良好，泳道1～3分別為(AC)12，(AG)12，(AAC)8探針雜交捕獲的 DNA 經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物。從約2000個(gè)轉(zhuǎn)化子中獲得240個(gè)陽性克隆。以寡核苷酸鏈A和探針為引物檢測陽性克隆中是否有微衛(wèi)星序列，如果PCR產(chǎn)物出現(xiàn)2條或2條以上的條帶，該克隆內(nèi)可能含有微衛(wèi)星插入片段［12］。如圖4 所示，泳道 1、2、3、5、7、8、9、10、11、12、13、16、18、19、20、21、24、25、26、28、29 均有可能是含有微衛(wèi)星片段的陽性克隆。

圖3 PCR檢測并富集捕獲目的片段的電泳圖譜Fig.3 Profile of the PCR testing of enriched captured DNA fragments

圖4 陽性克隆PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.4 Profile of the PCR amplification of screening for the presence of microsatellite repeats

圖5 探針雜交獲得克隆的測序結(jié)果圖Fig.5 Illustration of microsatellite－containing sequences

2.3 測序結(jié)果

挑選98個(gè)經(jīng)檢驗(yàn)可能含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆進(jìn)行測序。測序獲得的豚鼠微衛(wèi)星特征序列如圖5所示。由圖5可見，測序峰明確，無雜峰，2堿基重復(fù)均大于10次，3堿基重復(fù)均大于8次。

2.4 引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增

根據(jù)測序結(jié)果，選擇兩堿基重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)大于10次，三堿基重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)大于8次的序列用于引物設(shè)計(jì)。一共設(shè)計(jì)了35對微衛(wèi)星引物。經(jīng)PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，其中17對引物能夠穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出預(yù)期條帶。這17對引物的相關(guān)信息見表1。

表1 17個(gè)豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的相關(guān)信息Tab.1 Characteristics of 17 microstellite loci of guniea pig

3 討論

一個(gè)物種微衛(wèi)星位點(diǎn)的獲得一般有兩種方法:1)借鑒近緣物種已知的位點(diǎn)信息，即利用微衛(wèi)星側(cè)翼序列的相對保守性，將近緣物種已知的微衛(wèi)星引物用于目標(biāo)物種;2)直接從該物種基因組DNA中篩選。前者快捷方便，但是前提是有相關(guān)信息可以借鑒，對于豚鼠這樣分類地位較特殊、與大部分模式生物的同源性都較低的物種，這種方法就不合適。直接從物種基因組DNA中篩選微衛(wèi)星的方法可以應(yīng)用于任何物種，方法也有很多［13－16］。早期的一些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率低下［17］。近10年來，出現(xiàn)了許多新的篩選方法:基于 RAPD的 PIMA法［15］，雖然簡單快速且只需要使用PCR技術(shù)即可實(shí)現(xiàn)，但所得克隆的陽性率較低。而基于AFLP技術(shù)的篩選方法［16］則過于依賴富集的成效。近年來磁珠富集法被廣泛地應(yīng)用于微衛(wèi)星篩選研究中［17－19］，其優(yōu)點(diǎn)在于篩選效率高、陽性克隆率高［20］。本研究選用了磁珠富集法，并在以下步驟進(jìn)行了優(yōu)化:(1)限制性內(nèi)切酶的選擇。根據(jù)文獻(xiàn)資料，本研究最初選取了HaeⅢ，RsaⅠ，AluⅠ，NheⅠ和 SAU3AⅠ五種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行嘗試［21］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前四種酶作用產(chǎn)生的DNA片段均為平末端。相比于SAU3AⅠ作用產(chǎn)生的粘性末端，平末端DNA片段與接頭的連接效率比較低，導(dǎo)致后續(xù)步驟中的PCR擴(kuò)增很難得到理想的結(jié)果。經(jīng)過比較，本研究最終選取了SAU3AⅠ作為唯一的限制性內(nèi)切酶。(2)雜交后洗脫條件的選擇。雜交后的洗脫條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。一方面如果洗脫條件太過嚴(yán)謹(jǐn)(洗脫溫度過高、SSC濃度過低)會丟失很多含有微衛(wèi)星序列的片段;另一方面如果洗脫條件太寬松(洗脫溫度過低、SSC濃度過高)則會得到很多無效片段，降低陽性克隆率。

本研究選擇磁珠富集法對實(shí)驗(yàn)豚鼠進(jìn)行微衛(wèi)星篩選，在實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)物種特點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了一套穩(wěn)定、高效的篩選方法。通過這一方法成功篩選得到17對豚鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)。這一套分子標(biāo)記可以用于實(shí)驗(yàn)豚鼠遺傳分析和多樣性鑒定，成為實(shí)驗(yàn)豚鼠種群遺傳檢測和遺傳育種的有力工具。

［1］蔣建敏，陳民利.實(shí)用醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］.浙江:浙江人民出版社，2009:44－46.

［2］Kunieda T，Kobayashi E，Tachibana M，et a1.Polymorphicmicrosatellite loci of the rat(Rauus norvegicus)［J］.Mamm Genome，1992，3(10):564－567.

［3］張樹輝，魏泓，史景泉.近交系小鼠微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的研究［J］.遺傳，2000，22(6):375－378.

［4］李瑞生，董罡，吳曉燕，等.微衛(wèi)星DNA監(jiān)控大鼠近交系的培育［J］.遺傳，2006，28(7):821－824.

［5］趙太云，路靜，王鉅，等.大、小鼠微衛(wèi)星引物對長爪沙鼠的擴(kuò)增［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(2):114－117.

［6］朱玉峰，任文陟，張嘉保，等.家兔微衛(wèi)星標(biāo)記群體遺傳變異快速分析方法的建立［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2004，14(6):363－367.

［7］李彩霞，凌鳳俊，涂政，等.犬的三個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23(5):80－81.

［8］李瑞生，孫琪云，孫巖松，等.恒河猴群微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的分析［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，13(1):51－54.

［9］Dan G，Winston A，Wen－Hsiung L.Is the guinea－pig a rodent［J］?1996，Nature，351:649－652.

［10］Anna MD，Carmela G，Graziano P，et al.The guinea－pig is not a rodent［J］.1996，Nature，381:597－560.

［11］Sambrook J，Russell DH.Molecular cloning:a laboratory manual(2nd)［M］.New York:CSHL Press，2001.

［12］Bloor PA，Barker FS，Watts PC，et al.Microsatellite libraries by enrichment［R/OL］.2001.http://www.genomics.liv.ac.uk/animal/Protocol1.html.

［13］Ostrander EA，Jong PM，Rine J，et al.Construction of smallinsert genomic DNA libraries highly enriched for microsatellite repeat sequences［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1992，89:3419－3423.

［14］Karagyzov L， Kalcheva ID， Chapman VM.Construction of random small－insert genomic libraries highly enriched for simple sequence repeats［J］.Nucleic Acids Res，1993，2l:391l－39l2.

［15］Lunt DH，Hutchinson WF，Carvalho GR.An efficient method for PCR based identification of microsatellite arrays(PIMA)［J］.Mol Eco1，1999，8:893－894.

［16］Zane L，Bargelloni L，Patarnello T.Strategies for microsatellite isolation:a review［J］.Mol Ecol，2002，11:1－16.

［17］Gonzalez EG，CastillaAM，ZardoyaR.Novelpolymorphic microsatellites for the red－legged partridge(Alectoris rufa)and cross－species amplification in Alectoris graeca［J］.Mol Ecol Notes，2005，5:449－451.

［18］Dane MH.Isolation and characterization of eight microsatellite loci from the house finch(Carpodacus mexicanus)［J］.Mol Ecol Notes，2005，5:443－445.

［19］Cardia P， Ferrero ME， Gon?alvesD， et al. Isolation of polymorphic microsatellite loci from Eurasian woodcock(Scolopax rusticola)and their cross－utility in related species［J］.Mol Ecol Notes，2007，7:130－132.

［20］James PC，Pammi S，Muhammad JI，et al.A high throughput procedure for capturing micmsatellites from complex plant genomes［J］.Plant Mol Biol Rep，1998，16:341－349.

［21］Hamilton MB，Pincus E，F(xiàn)iore A，et al.Universal linker and ligation procedures for construction of genomic DNA libraries enriched for microsatellites［J］.Biotechniques，1999，27:500－507.

Microsatellite Enrichment by Magnetic Beads in Guinea Pig(Cavia porcellus)

ZHU Liang，CAI Yue－qin，TU Jue，YING Hua－zhong，XU Jian－qin，CHEN Min－li
(Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

Objective To isolate microsatellite loci from guinea pig(Cavia porcellus)genome.Methods The 200～1000 bp DNA fractions of guniea pig containing microsatellite sequences were captured by hybridization with the oligonucleotide probes attached to streptavadin coated magnetic beads.The enriched DNA were ligated into pMD－18T and then transformed into E.coli DH5α competent cells.The method of PCR was used to screen positive clones from the libraries.And microsatellite primers were disigned based on the sequences from the positive clones.Results In total 240 positive clones were identified from about 2000 transformants in the libraries screened by PCR.Finally，we got 98 sequences and successfully designed 17 pairs of microsatellite primers for guniea pig.Conclusions The results showed that this method is very efficient to isolate microsatellite markers and the markers are useful tools for further studies on guinea pig genetics.

Guinea pig;Magnetic beads enrichment;Microsatellite

R394

A

1671－7856(2010)06－0029－06

2010－01－06

浙江省科技廳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺項(xiàng)目(2008F80024)。

朱亮(1978－)，女，助理研究員，博士，研究方向:動(dòng)物分子遺傳。E－mail:tozhuliang@126.com