(中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410083)

在紡織工業(yè)中，耐高溫的α-淀粉酶可以作為退漿酶將織物的漿料退漿除去，并且具有有效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[1]。產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的菌種有許多，目前，研究和應(yīng)用較多的是芽孢桿菌屬(Bacillus)[2]，常用的是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheninformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)等。另外，也有關(guān)于嗜熱細(xì)菌和古菌的研究[3]，不過(guò)它們最適生長(zhǎng)溫度較高，多為80 ℃以上，生長(zhǎng)條件較苛刻，并不適合工業(yè)化生產(chǎn)的要求。因此，常溫菌株芽孢桿菌屬(Bacillus)仍然是研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)篩選，獲得一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，命名為Bacillus subtilis C1，并對(duì)其所產(chǎn)粗酶的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了研究?，F(xiàn)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，以確定其最優(yōu)發(fā)酵條件。Minitab作為世界著名的數(shù)據(jù)分析軟件，具有強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(design of experiments，DOE)功能及數(shù)據(jù)管理、統(tǒng)計(jì)分析等功能[4]。在此，本文作者進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)[5]、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)[6]和 Box-Behnken等實(shí)驗(yàn)[7]，并利用 Minitab軟件對(duì)Bacillus subtilis C1發(fā)酵生產(chǎn)的相關(guān)影響因素進(jìn)行研究和探索。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種由本實(shí)驗(yàn)室選育。

種子培養(yǎng)基成分為：淀粉 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 1%。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：麩皮 1%，棉粕粉 1%，酵母粉 0.2%，NaCl 0.5%。

采用500 mL搖瓶盛裝200 mL培養(yǎng)基。

1.2 粗酶液制備

采用三角瓶(500 mL)裝培養(yǎng)基200 mL，接種后于45 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，在4 ℃取發(fā)酵液于10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.3 酶活測(cè)定

采用Yoo改良法測(cè)定酶活[8?9]。在20 mL試管中加入5 mL 0.5%淀粉溶液(用pH=6.0磷酸鹽緩沖液新鮮配制)，在70 ℃預(yù)熱10 min。然后加入稀釋一定倍數(shù)的0.5 mL酶液，在70 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，加入5 mL 0.1 mol/L HCl終止反應(yīng)。取0.5 mL反應(yīng)液加入盛有5 mL 0.4 mmol/L I2-KI溶液的試管中顯色。在波長(zhǎng)為620 nm處測(cè)定吸光度。酶活力單位U定義：在pH為6.0、溫度為70 ℃、于5 min水解1 mg淀粉所需的酶量。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單次單因素法[10]，假設(shè)各因素間不存在交互作用，1次改變培養(yǎng)基的1個(gè)因素的水平而其他因素保持不變，然后逐個(gè)進(jìn)行考察優(yōu)化。

作為Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備，此實(shí)驗(yàn)用來(lái)確定最佳C源、N源、溫度和初始pH、轉(zhuǎn)速等。1.4.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(PBD)[11]被稱作篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)因素較多時(shí)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不方便，且不考慮交互作用時(shí)，才會(huì)考慮使用此方法。雖然與其他方法相比，Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不能區(qū)分主效應(yīng)與交互作用的影響，但可以確定對(duì)結(jié)果影響顯著的因素，從而達(dá)到篩選的目的。

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)對(duì)每個(gè)因素取2個(gè)水平來(lái)進(jìn)行分析，通過(guò)比較各因素2個(gè)水平的差異與整體的差異來(lái)確定因素的顯著性。通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的篩選，能避免在后期的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中由于因素?cái)?shù)太多或部分因素不顯著而造成的實(shí)驗(yàn)資源浪費(fèi)。

利用Minitab軟件創(chuàng)建Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素取2個(gè)水平。按照傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方式，高水平一般為低水平的 1.0～1.5倍。在前期單因素實(shí)驗(yàn)獲得結(jié)果的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選取影響較大的6個(gè)因素，即基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分：麩皮、棉粕粉、酵母粉、NaCl以及用于穩(wěn)定酶構(gòu)象而使酶活增加的 CaCl2和誘導(dǎo)物淀粉。其他因素如溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速等均恒定，選用變量個(gè)數(shù)N=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)表，另加3個(gè)虛擬變量，用于考察實(shí)驗(yàn)誤差。各因素所代表參數(shù)、水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Plaekett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)和水平Table 1 Factors levels of Plackett-Burman design

1.4.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面的擬合方程必須在緊接鄰域內(nèi)才近似真實(shí)情形，在其他區(qū)域，擬合方程與被近似的方程毫無(wú)相似之處，幾乎無(wú)意義；因此，找出主要因素后，必須通過(guò)使主要因素同時(shí)朝向響應(yīng)值的最大方向變化，逼近最大響應(yīng)區(qū)間，找出峰值，才能建立有效響應(yīng)面方程[12]。在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中，對(duì)酶活影響不顯著的其他因素取最低水平，而影響顯著的3個(gè)因素以實(shí)驗(yàn)值的變化方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值與比例來(lái)確定變化步長(zhǎng)，最快地逼近最佳值區(qū)域。

1.4.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Box-Behnken(BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種常用的響應(yīng)面分析法，用來(lái)評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，估計(jì)一階、二階與一階交互作用項(xiàng)的多項(xiàng)式模式，是一種有效的響應(yīng)面設(shè)計(jì)法[13]。

表2 Plaekett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 2 Design matrix and experimental results of Plackett-Burman design

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 3 Design matrix and experimental results of Box-Behnken design

結(jié)合前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Minitab軟件創(chuàng)建Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)因素為麩皮、棉粕粉和淀粉，每個(gè)因素取3個(gè)水平。實(shí)驗(yàn)共有15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中有12個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)零點(diǎn)。對(duì)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，以估計(jì)誤差。

Adinarayana等[14]論述了響應(yīng)面法的主要原理。根據(jù)用多項(xiàng)式回歸分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，可得到二次多項(xiàng)式。它是一個(gè)描述響應(yīng)變量(因變量)與自變量(操作條件)關(guān)系的模型。

其中：Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值；β0，βi，βii和βij分別為常量、一次項(xiàng)系數(shù)、二次項(xiàng)系數(shù)和交互作用系數(shù)；Xi為自變量編碼，

xi為自變量真實(shí)值；x0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量；xΔ為自變量的變化步長(zhǎng)。

2 結(jié)果分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

利用Minitab對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表4所示，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為61.041 0，預(yù)測(cè)誤差平方和為268 272，回歸方程的系數(shù)R2為0.985 8；調(diào)整后R2為0.921 9。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析結(jié)果Table 4 Analytic result of Plackett-Burman experiment design

從單因素效應(yīng)的檢驗(yàn)結(jié)果可以看出：主效應(yīng)中，因素A(麩皮)、B(棉粕粉)、E(淀粉)效應(yīng)顯著，其P分別為0.044，0.014和0.025，均小于0.050，可以作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。其他因素對(duì)結(jié)果影響不大，在進(jìn)一步研究中，取中間水平，對(duì)影響效果不進(jìn)行分析。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)因素A(麩皮)對(duì)酶活具有正促進(jìn)作用，B(棉粕粉)、E(淀粉)對(duì)酶活具有負(fù)促進(jìn)作用，適當(dāng)增加A(麩皮)，減少B(棉粕粉)、E(淀粉)的量，會(huì)使酶活增加。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表5所示。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 5 Design matrix and experimental results ofsteepest accent

由表5可知：第4組實(shí)驗(yàn)的酶活最大。這說(shuō)明最優(yōu)點(diǎn)在第4組實(shí)驗(yàn)附近。故以實(shí)驗(yàn)4的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)，麩皮、棉粕粉、淀粉質(zhì)量分別為2.20，1.80和0.11 g，進(jìn)行下一步研究。

2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Minitab進(jìn)行分析，并得出回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)、方差分析結(jié)果分別如表6～7所示。

由表6可知酶活與麩皮、棉粕粉、淀粉含量的關(guān)系可用下列回歸方程來(lái)表示：Y=2 335.43+75.40X1?49.38X2?33.02X3?48.38X12?223.67X22?61.55X32?13.37X1X2?3.29X1X3?32.92X2X3(3)其標(biāo)準(zhǔn)偏差為39.964 9，預(yù)測(cè)誤差平方和為98 942.3，回歸方程的系數(shù)R2為0.971 7；R2經(jīng)調(diào)整后為0.920 6。

表6 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Significance test of regression coefficient

表7 回歸方程的方差分析Table 7 ANOVA for regression equation

從表6可以看出，模型方程中常數(shù)項(xiàng)P為0，表明該模型是顯著的。同時(shí)，模型中的參數(shù)X1，X2，X2*X2，X3*X3的P分別為0.003，0.017，0和 0.032，均小于0.050，表明這些參數(shù)也是顯著的。

失擬(Lack-of-Fit)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率，反應(yīng)擬合出來(lái)的模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的接近程度。從表7可知：模型失擬檢驗(yàn)的P為0.367，大于0.050，因此，回歸模型適合，不需對(duì)回歸議程調(diào)整。Joglekar等[15]認(rèn)為：1個(gè)相關(guān)性好的回歸模型，R2不應(yīng)低于0.8。從表6所示數(shù)據(jù)可得：R2為 0.971 7，調(diào)整后R2為0.920 6，這2個(gè)值高于0.900 0且較接近，表示可以使用該模型來(lái)分析響應(yīng)值。

各因素間交互作用對(duì)響應(yīng)的影響如圖1～3所示?？梢?jiàn)：麩皮和棉粕粉、棉粕粉和淀粉間的交互作用對(duì)酶活的影響顯著，而麩皮和淀粉間交互對(duì)酶活影響不顯著。為了進(jìn)一步驗(yàn)證最佳值，對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，令一階偏導(dǎo)等于0，并整理得：

圖1 麩皮(X1)和棉粕粉(X2)交互作用對(duì)酶活的影響的響應(yīng)曲面Fig.1 Response surface plot for interaction effects of wheat bran and cotton seed meal on enzyme activity

圖2 麩皮(X1)和淀粉(X3)交互作用篤酶活的影響的響應(yīng)曲面Fig.2 Response surface plot for interaction effects of wheat bran and starch on enzyme activity

圖3 棉粕粉(X2)和淀粉(X3)交互作用對(duì)酶活的影響的響應(yīng)曲面Fig.3 Response surface plot for interaction effects of cotton seed meal and starch on enzyme activity

解上述方程組，得各因素編碼分別為X1=0.80，X2= ?0.12，X3= ?0.26。代入式(3)，可得Y=2 372.86。又由各因素編碼與其真實(shí)值之間的關(guān)系，可求得當(dāng)酶活為2 372 U/mL時(shí)，麩皮、棉粕粉和淀粉真實(shí)質(zhì)量分別為2.16，1.98和0.10 g。為了對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，用以上得到的最優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得平均酶活為2 329 U/mL，與預(yù)測(cè)值(2 372 U/mL)相差 1.83%，證實(shí)了模型的有效性。酶活為優(yōu)化前酶活(185.60 U/mL)的12.55倍。

3 結(jié)論

(1) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，借助 Minitab 將響應(yīng)面法應(yīng)用于產(chǎn)耐高溫 α-淀粉酶生產(chǎn)菌株Bacillus subtilis C1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化?；貧w分析結(jié)果表明：麩皮和棉粕粉、棉粕粉和淀粉間的交互作用對(duì)酶活的影響顯著。

(2) 通過(guò)對(duì)響應(yīng)方程的回歸分析，得到 Bacillus subtilis C1培養(yǎng)基的最佳成分(200 mL)：麩皮2.16 g，棉粕粉1.98 g，酵母粉0.40 g，NaCl 1.00 g，CaCl20.40 g，淀粉0.10 g。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該營(yíng)養(yǎng)條件下的酶活為2 329 U/mL，約是培養(yǎng)基優(yōu)化前酶活的12.55 倍，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。

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