顏焱娜,楊紅武,劉仁萍,吳民熙,曾 熾,孫天瑋,吳永堯

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128

油脂下腳料降解菌的選育

顏焱娜,楊紅武,劉仁萍,吳民熙,曾 熾,孫天瑋,吳永堯＊

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128

從油污土樣等樣品分離獲得兩種高產(chǎn)蛋白酶的菌株,命名為M1、DB2,其酶活力分別 213.04,206.95 U/ mL。利用該兩株菌分別對(duì)大豆粕,芝麻粕,菜籽粕作為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行了初步的降解蛋白能力比較研究,結(jié)果表明M1、DB2均能很好的降解三種粕中的粗蛋白。M1、DB2的最適生長(zhǎng)溫度分別為 30、35℃,最適生長(zhǎng) pH分別為 7、8,最佳生長(zhǎng)時(shí)間分別為 12、32 h。初步鑒定M1、DB2為芽孢桿菌屬。

大豆粕;芝麻粕;菜籽粕;蛋白酶;芽孢桿菌(Bacillissp.)M1和DB2

餅粕是利用油料作物的籽實(shí)提取油脂后的產(chǎn)品[1]。餅粕中含有 30%～50%的粗蛋白質(zhì),氨基酸組成較全面[2],是一種良好的蛋白資源。我國(guó)每年油脂下腳料總量在 1000萬(wàn)噸以上,然而餅粕中大多含有抗?fàn)I養(yǎng)因子,導(dǎo)致這種優(yōu)良蛋白質(zhì)資源沒(méi)有得充分利用,甚至廢棄,這無(wú)疑造成了環(huán)境污染和自然資源的極大浪費(fèi)[3]。為此本項(xiàng)目組以大豆粕,芝麻粕,菜籽粕為基質(zhì),篩選高效降解餅粕粗蛋白的菌株,將餅粕通過(guò)生物發(fā)酵處理后,使餅粕中的各種抗原成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子被有效降低去除,餅粕中的蛋白質(zhì)被分解成大量的植物小肽。這種無(wú)抗原的植物小肽吸收率高,可作為優(yōu)良蛋白質(zhì)來(lái)源[4]等,為餅粕綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

高壓滅菌鍋;恒溫培養(yǎng)箱;HZQ-Q振蕩器;凱氏定氮裝置。

大豆粕、芝麻粕、菜籽粕為湖南金葉肥料公司提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

分離純化培養(yǎng)基:固體肉湯培養(yǎng)基[5]。

初篩培養(yǎng)基:酪蛋白培養(yǎng)基[6]。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基:芝麻粕 5 g,pH 7.5的緩沖液45 mL,NaCl 0.5%;大豆粕 5 g,pH 7.5的緩沖液 45 mL,NaCl 0.5%;菜籽粕 5 g,pH 7.5的緩沖液 45 mL,NaCl 0.5%復(fù)篩培養(yǎng)基:芝麻粕 100 g(40目篩),pH自然,50%水;大豆粕 100 g(40目篩),pH自然,50%水;菜籽粕 100 g(40目篩),pH自然, 50%水。

涂料、瓷磚、地板、櫥柜所用板材，甚至部分高價(jià)施工輔料，隨時(shí)存在“被偷換”的可能，因此業(yè)主們常常被告誡，要經(jīng)常去工地監(jiān)工。但事實(shí)上，工人想偷換材料并不那么容易。比如一般電線和電纜等施工輔材上都印有品牌的標(biāo)識(shí)，從暗盒處能看到，如果工人偷換，很容易被發(fā)現(xiàn)。

1.2.2 菌種分離純化

將土壤制成懸濁液并稀釋后,均勻涂布于固體肉湯培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng) 2 d,挑取單菌落并接種至斜面培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株篩選

將斜面菌株,分別接種于酪蛋白培養(yǎng)基平板中,放入 37℃恒溫箱,培養(yǎng) 48 h,比較生長(zhǎng)菌落直徑及透明圈直徑[7]。(2)將酪蛋白培養(yǎng)基平板篩選的優(yōu)勢(shì)菌株接種至產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵 48 h后,發(fā)酵液用于冷凍離心機(jī) 6000 r/min離心 15 min,取上清液 1 mL,稀釋 20倍用福林酚法測(cè)定發(fā)酵液中的蛋白酶活力[8],選取蛋白酶活力高的菌株為復(fù)篩出發(fā)菌。

1.2.4 菌株降解三種粕能力比較

經(jīng)過(guò)初篩獲得的優(yōu)勢(shì)菌株分別接種 10%到復(fù)篩培養(yǎng)基中發(fā)酵 7天后,檢測(cè)其中的總氮含量、蛋白氮含量、非蛋白氮含量[9]。其中總氮含量的測(cè)定[8]:采用凱氏定氮法。蛋白氮含量的測(cè)定:稱(chēng)取 5 g樣品加 10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 6%硫酸銅溶液,靜置過(guò)夜,過(guò)濾收集沉淀,用凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量(硝化時(shí)連同濾紙一起放入凱氏瓶?jī)?nèi)硝化)。

粗蛋白含量 =蛋白氮含量 ×6.25

非蛋白氮含量 =總氮含量 -蛋白氮含量

1.2.5 菌株生長(zhǎng)特性

分別考察以下單因素對(duì)M1、DB2生物量的影響:(1)培養(yǎng)時(shí)間分別為 4、8、12、16、20、24、28、32、36 h;(2)培養(yǎng)溫度分別為 30、35、40、45、50、55℃; (3)培養(yǎng)基的 PH分別 4、5、6、7、8、9,從而了解該兩株菌的生長(zhǎng)特性,其中生物量大小以發(fā)酵液在600nm吸光度大小表示。

1.2.6 菌種的初步鑒定

根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,對(duì)篩選菌株進(jìn)行初步鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株產(chǎn)蛋白酶活性比較

從油污土樣等樣品中獲得 8株產(chǎn)蛋白酶菌株,即 T1、T2、T5、B1、M1、X1、DB2、CH1、CH3,為了進(jìn)一步比較它們產(chǎn)蛋白酶活力,分析了該 8株菌在大豆粕,芝麻粕,菜籽粕三種產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)蛋白酶能力。結(jié)果見(jiàn)表 1,M1、DB2在大豆粕酶活較高,其中M1達(dá)到了213.04 U/mL,DB2達(dá)到了 206.95 U/ mL,與有關(guān)研究[9]比較,可知該兩株菌的酶活力較高,可作為良好的出發(fā)菌株。而M1、DB2在芝麻粕、菜籽粕中酶活力均只有 35 U/mL左右,酶活力不高,這可能是芝麻粕,菜籽粕中的營(yíng)養(yǎng)成分與大豆粕不同,不利于M1、DB2的生長(zhǎng)代謝,從而影響它們的蛋白酶表達(dá)水平。但相對(duì)于其他菌株在芝麻粕、菜籽粕中產(chǎn)酶能力的比較,M1、DB2仍表現(xiàn)為蛋白酶活較高,故選取M1、DB2兩株菌進(jìn)行降解不同粕中蛋白質(zhì)能力比較。

表 1 蛋白酶產(chǎn)生菌株在不同粕中產(chǎn)蛋白酶活力Table 1 Protease activity by protease producer in different oil cakes

2.2 不同菌株降解三種粕蛋白能力的比較

表 2 三種粕粗蛋白降解效果Table 2 Degradation effect of protease in the three different oil cake

將初篩得到的菌株分別接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中,以未發(fā)酵粕為對(duì)照。通過(guò)分析了經(jīng)降解后的三種粕中總氮的含量,蛋白氮含量,非蛋白氮含量,比較不同菌株降解這三種粕蛋白的能力,結(jié)果見(jiàn)表 2?？芍?M1、DB2對(duì)粕蛋白質(zhì)的降解顯著性高于未發(fā)酵的粕 (P＜0.05),這說(shuō)明它們對(duì)三種粕都具有很好的降解能力。其中M1使大豆粕、芝麻粕、菜籽粕中的蛋白氮含量分別下降 31.0%;11.5%;29.67%。DB2分別使大豆粕、芝麻粕、菜籽粕中蛋白氮下降34.8%;16.1%;27.12%。M1,DB2兩株菌各自降解大豆粕中的蛋白質(zhì)能力顯著性高于降解芝麻粕中的蛋白質(zhì) (P＜0.05)。產(chǎn)生這一差異的原因可能是該三種粕主要成分有差異,三種粕中粗脂肪含量依次為大豆粕 ＜菜籽粕 ＜芝麻粕,無(wú)氮浸出物含量依次為大豆粕 ＞菜籽粕 ＞芝麻粕,粗脂肪含量越低,無(wú)氮浸出物含量越高可能越有利于M1、DB2兩株菌的生長(zhǎng)及蛋白酶的合成。

2.3 菌株的生長(zhǎng)特性

考察了溫度、時(shí)間、pH對(duì)M1,DB2菌株的生物量影響,結(jié)果見(jiàn)圖 1～3。由圖可知,M1菌株最佳生長(zhǎng)條件為溫度為 30℃,時(shí)間為 12 h,pH值為 7時(shí); DB2菌株最佳生長(zhǎng)條件溫度為 35℃,時(shí)間為 32 h, pH值為 8時(shí)。M1的生長(zhǎng)速度較快,DB2的耐高溫性較強(qiáng)。產(chǎn)生這種差異可能與菌株種屬差異有關(guān),為此對(duì)兩株菌株形態(tài),生化生理特性進(jìn)行了初步鑒定。

圖 1 溫度對(duì)菌株影響Fig.1 Effect of temperature on the strains

2.4 初步鑒定結(jié)果

根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,對(duì)其形態(tài)及培養(yǎng)特征進(jìn)行了初步鑒定M1,DB2為芽孢桿菌屬B acillissp.M1和DB2。

3 結(jié)語(yǔ)

從油污土樣等樣品分離獲得兩種高產(chǎn)蛋白酶的菌株 M1、DB2。其在大豆粕中酶活力分別為213.04,206.95 U/mL。M1、DB2均能很好的降解三種粕中的粗蛋白,其中兩株菌降解大豆粕中的蛋白質(zhì)能力顯著性高于降解芝麻粕中的蛋白質(zhì) (P＜0.05)。

M1、DB2為產(chǎn)中性蛋白酶菌株,M1,DB2的最適生長(zhǎng)溫度分別為 30、35℃,最適生長(zhǎng) pH分別為 7和 8,最佳生長(zhǎng)時(shí)間分別為 12、32 h。兩株菌均為革蘭氏染色陽(yáng)性菌,桿狀菌株,含有孢子,其中 DB2耐熱性較好,初步鑒定為芽孢桿菌屬。

綜上所述,M1、DB2可作為降解大豆粕粗蛋白的優(yōu)良菌株,為餅粕綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料和試驗(yàn)依據(jù)。

1 Xue ZC(薛志成).The rational use ofMeal in animal feed.The Anim al Feed in Hunan(湖南飼料),2005,3:28-29.

2 Xiao SP(肖世平),QiLH(漆林花).The nutritional value of rapeseed meal and hang-nutritional factor.The An im al Feed in Guangdong(廣東飼料),1995,6:11-13.

3 Wang XS(汪習(xí)生),Nuo JQ(羅繼權(quán)).Swill restaurant waste oil and waste an imal and vegetable oils is deserve to use deeply.Study on Renewable Resources(再生資源研究), 2001,3:24-26.

4 Wei L(衛(wèi)琳),Song JM(宋俊梅),Huang YF(黃永鋒). Researching and applicating the Solid-state fermentation of soybean meal in animal feed.The Use of New Technologies in the Protein RawMaterial(蛋白原料應(yīng)用新技術(shù)),2008, 8:12-13.

5 Du LX(杜連祥),Lu FP(路福平).Microbiology of Laboratory Technicians(微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)).Beijing:China Light Industry Press,2005,8(1):349-350.

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7 Jiang XR(姜錫瑞).The Manual of Enzyme Preparation(酶制劑運(yùn)用手冊(cè)).Beijing:China Light Industry Press,1999, 2(1):292-297.

8 Qiu X(邱鑫),Xiao HQ(肖漢乾),Xiang TY(向天勇),et al.Screening,identification and fer mentation conditions of the crude protein-degradative strain.Am ino Acids&B iotic Resources(氨基酸和生物資源),2005,27(1):1-5.

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Isolation of Stra insDegrading the Garbage of O il and Fat

YAN Yan-na,YANG Hong-wu,L IU Ren-ping,WU Min-xi,ZENG Chi,SUN Tian-wei,WU Yong-yao＊
College of B ioscience and B iotechnology,HNAU,Changsha 410128,China

Two high yield proteases-producing strains named asM1,DB2 were isolated from the Oil-contaminated soil samples.The protease activities ofM1,DB2 were 213.04,206.95 U/mL,respectively.The results showed that the content of protein in soybean meal,sesame meal,rapeseed meal has descended after fermentation with M1,DB2.The optimum temperature forM1,DB2 growth were 30,35℃,The optimum pH forM1,DB2 growthwere 7,8.The optimum time forM1,DB2 growth is 12,32 h.Theywere all identified asBacillissp.M1,Bacillissp.DB2

Soybean meal;sesame meal;rapeseed meal;protease;Bacillissp.M1,DB2

Q939.97

A

1001-6880(2010)04-0674-04

2009-03-17 接受日期:2009-07-07

湖南省中南煙草實(shí)驗(yàn)站項(xiàng)目(08-10Aa02)

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:yywu357@sohu.com