康文藝,宋艷麗,張 麗

河南大學(xué)中藥研究所,開封 475004

帽蕊木α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

康文藝＊,宋艷麗,張 麗

河南大學(xué)中藥研究所,開封 475004

利用體外抑制α-葡萄糖苷酶模型,首次對(duì)植物帽蕊木葉、皮提取物和從中分離得到的化合物進(jìn)行活性評(píng)價(jià),并與陽性對(duì)照Acarbose進(jìn)行比較。結(jié)果表明帽蕊木葉和皮提取物都具有很高抑制α-葡萄糖苷酶活性,且葉的活性要好于皮,同一部位的正丁醇和乙酸乙酯提取物的活性要好于石油醚提取物;從帽蕊木中得到的化合物莨菪內(nèi)酯 (scopletin)的α-葡萄糖苷酶抑制活性 (I C50=35.03μg/mL)高于陽性對(duì)照 Acarbose(IC50=1081.27 μg/mL)約為其活性的 30倍。

帽蕊木;α-葡萄糖苷酶;抑制活性

帽蕊木 (M itragyna rotundifoliaKuntze.)為茜草科帽蕊木屬植物。本屬植物約有 10種,非洲分布 4種,亞洲 6種,分布在印度,孟加拉,緬甸,泰國和老撾等國家[1-3]。我國僅有 1種,產(chǎn)于云南南部[4,5]。該屬的植物民間用途廣泛,可用于發(fā)熱、疝氣、肌肉疼痛的治療[6,7],抗瘧[8],并可以驅(qū)蟲[9]。文獻(xiàn)研究表明,帽蕊木屬植物化學(xué)研究主要集中在吲哚類生物堿成分上[10,11],藥理研究也非常明確,主要集中在抗腫瘤、心血管疾病和抗菌活性。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性,延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收,從而有效降低餐后高血糖。由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),目前已被廣泛用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治,臨床上主要使用阿卡波糖和伏格列波糖等。作者在對(duì)產(chǎn)于云南西雙版納的帽蕊木進(jìn)行系列研究中[12-16],共得到 28個(gè)化合物。本文利用體外抑制α-葡萄糖苷酶模型,首次對(duì)帽蕊木提取物及其從中得到的 28個(gè)化合物進(jìn)行α-葡萄糖苷酶活性篩選,發(fā)現(xiàn)莨菪內(nèi)酯(scopletin)具有較好的抑制α-葡萄糖苷酶活性。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase,EC 3.2.1.20);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG,026K1516);阿卡波糖 (Acarbose,Lot 16869)和 DMSO均購自 Sigma公司;帽蕊木于 2006年 10月采集于云南西雙版納地區(qū),經(jīng)中國科學(xué)院西雙版納植物園崔景云高級(jí)工程師鑒定為茜草科帽蕊木屬植物帽蕊木M.rotundifoliaKuntze,標(biāo)本存于河南大學(xué)天然藥物研究所 (No.0610221)。

1.2 儀器

MultiskanMK3酶標(biāo)儀 (Ther mo Electron);LRH-150恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒科技有限公司);DELTA 320型 PH計(jì) (Mettler-Toledo);電子天平 (Mettler-Toledo)。

2 方法

2.1 提取物制備

帽蕊木莖皮和葉干燥,粉碎后,分別用 V(丙酮)∶V(水)=7∶3室溫下冷浸 3次,每次 7 d?；厥赵噭┖蠓謩e得到帽蕊木莖皮浸膏和葉浸膏。分別將浸膏懸浮于水中,依次向懸浮液中加入石油醚、乙酸乙酯和正丁醇,振搖萃取。萃取液真空減壓干燥,分別得到帽蕊木皮和葉石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性成分的篩選方法

2.2.1 檢測(cè)方法

在 96孔板上進(jìn)行,反應(yīng)體系參照張麗建立[17]的方法,按照 I%=[1-(OD樣品-OD樣空)/(OD陰性-OD空白)]×100%計(jì)算抑制率,并用Origin軟件求出相應(yīng) IC50值。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

根據(jù)采用的反應(yīng)體系,用磷酸緩沖液 (pH 6.8)配置 1000μmol/L PNP,稀釋成 400、300、200、150、100、50、25、5和 0μmol/L。分別取 9種不同濃度的PNP溶液各160μL,加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL,混勻,在 405 nm下測(cè)定 OD值,測(cè)三組取平均值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo),對(duì)硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo),做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 α-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定

根據(jù)所采用的反應(yīng)體系:112μL磷酸鉀緩沖液(pH 6.8),加入 20μL 0.2 U/mLα-糖苷酶,8μL DMSO,37℃恒溫 15 min后加入 2.5 mmol/L PNPG 20μL,37℃恒溫反應(yīng) 15 min。再加入 80μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液,于 405 nm波長下測(cè)OD值。

酶活力單位定義:37℃、pH 6.8條件下,每分鐘水解底物所產(chǎn)生 1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量,規(guī)定為一個(gè)酶活力單位 (U)[17]。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取物活性的比較分析

表 1顯示,同一濃度下,帽蕊木不同溶劑提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性從大到小依次為:帽蕊木葉正丁醇提取物 ＞帽蕊木皮正丁醇提取物 ＞帽蕊木葉乙酸乙酯提取物 ＞帽蕊木皮乙酸乙酯提取物 ＞帽蕊木皮石油醚提取物 ＞Acarbose＞帽蕊木葉正丁醇提取物。而從帽蕊木皮中得到的化合物 Scopletin在濃度為 100μg/mL時(shí),對(duì)α-葡萄糖糖苷酶的抑制率已達(dá)到 81.59%。

由以上初篩抑制率為指導(dǎo),對(duì)帽蕊木提取物進(jìn)行復(fù)篩,發(fā)現(xiàn):帽蕊木提取物中,葉抑制α-葡萄糖糖苷酶活性最高,乙酸乙酯和正丁醇提取物的 I C50值分別為 34.46μg/mL和 6.023μg/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照 acarbose(IC50=1081.27μg/mL);帽蕊木皮也具有很高的抑制α-葡萄糖糖苷酶活性,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物 (IC50值分別為 260.98、68.82、18.69μg/mL)都高于陽性對(duì)照 acarbose。

由此可見帽蕊木不同部位雖都具有很高的α-葡萄糖糖苷酶抑制活性,但抑制活性有所差別,葉的活性要好于皮。

另外,帽蕊木同一部位不同溶劑提取物相比較,乙酸乙酯和正丁醇提取物的活性高于石油醚提取物。說明帽蕊木的α-葡萄糖苷酶抑制活性不僅與部位有關(guān),還與提取物極性密切相關(guān)。從帽蕊木中得到的化合物 scopletin具有很強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活性 (I C50=35.03μg/mL),其對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度比陽性對(duì)照 acarbose約小 30倍。

表 1 不同提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 1 The inhibitory activity of extracts ofα-glucosidase

3.2 樣品濃度對(duì)α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的影響

圖 1顯示,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),帽蕊木不同部位不同溶劑提取物及從中分離得到的化合物 scopletin的α-葡萄糖苷酶抑制活性均呈劑量依賴性,而且,當(dāng)抑制率達(dá)到一定程度時(shí),再增加提取物質(zhì)量濃度,抑制活性不再提高。

圖 1 樣品濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.1 Effect of sample concentration on the activity ofαglucosidase

3.3 化合物 scopletin抑制類型的確定

化合物 scopletin取合適的兩個(gè)不同濃度,PNPG取 5個(gè)不同濃度,分別測(cè)定反應(yīng)速度。按 Lineweave-Burk作圖法,以 1/[S]為橫坐標(biāo) 1/V為縱坐標(biāo),分別繪制化合物的抑制作用動(dòng)力學(xué)曲線 (圖 2),得到α-葡萄糖糖苷酶的Km值為 2.89 mmol/L。

圖中可以看出,化合物 scopletin對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用屬非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,反應(yīng)速度Vmax隨著受試化合物濃度的增大而變小,米氏常數(shù)Km保持不變。根據(jù)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)方程[18,19]:1/V′max= 1/Vmax(1+[I]/Ki),可以求出化合物 Scopletin的Ki值分別為:2.44μg/mL。

圖 2 化合物 scopletin的 Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.2 The Lineweave-Burk of scopletin on the activity of α-glucosidase

4 結(jié)論

4.1 本文首次利用體外α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選模型對(duì)帽蕊木不同部位不同溶劑提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行了考察,結(jié)果表明帽蕊木葉和皮都具有很好的活性,且葉的活性好于皮。

4.2 化合物 scopletin具有很強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性 (I C50=35.03μg/mL),其對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度比陽性對(duì)照 acarbose約小 30倍,以期開發(fā)為天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

4.3 化合物 scopletin對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型,說明它既可以和酶,也可以和酶-底物復(fù)合物結(jié)合,從而降低酶活性,達(dá)到降低血糖作用。

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Inhibition ofα-Glucoside ofM itragyna rotundifoliaKuntze.

KANGWen-yi＊,SONG Yan-li,ZHANGLi
Institute of ChineseM ateria M edica,Henan University,Kaifeng 475004,China

The inhibitory activities ofα-glucosidase of leaves,barks extracts and compounds fromM itragyna rotundifoliaKuntze.were screenedin vitrofor the first t ime,and the results were compared with acarbose.The results showed that leaves and barks extracts fromM.rotundifoliaall had inhibitory activity ofα-glucosidase,and the activity of leaveswas higher than thatof barks.Then-butanol extract and ethyl acetate extract from the same partofM.rotundifoliahad higher inhibitory activity ofα-glucosidase than thatof the petroleum ether extract.The compound of scopletin had higher inhibitory activity ofα-glucosidase(I C50=35.03μg/mL),and the value of I C50was lowered about thirty times than that of positive control acarbose.

M itragyna rotundifoliaKuntze.;α-glucosidase;inhibitory activity

Q946.81;R285

A

1001-6880(2010)04-0658-04

2008-09-04 接受日期:2008-10-23

河南省教育廳基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2008A360002)

＊通訊作者 Tel:86-378-3880680;E-mail:kangweny@hotmail.com