劉 琦,田亞平

江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,無錫 214122

一種云芝發(fā)酵所產胃蛋白酶抑制劑的純化及部分性質研究

劉 琦,田亞平＊

江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,無錫 214122

云芝發(fā)酵液經超聲波細胞破碎,離心和大孔樹脂脫色得上清液。上清液再經 DEAE-52、Mono Q離子交換層析和UltroGelACA-54凝膠過濾分離得到一種胃蛋白酶抑制劑。它的成分是蛋白質,經UltroGelACA-54凝膠過濾和 SDS-PAGE鑒定為單亞基,相對分子量為 22.31 kDa。該抑制劑熱穩(wěn)定性良好,對胃酶有很強的抑制作用,半抑制濃度 IC50值為 29.26μg/mL,抑制類型屬于非競爭和反競爭混合型抑制模式,其Ki值為 0.996μmol/ L。

云芝;胃蛋白酶抑制劑;純化;層析

天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般是由兩個天冬氨酸殘基所組成,目前主要包括胃蛋白酶 (pepsin)、胃亞蛋白酶 (gastricsin)、凝乳酶 (chymosin)、溶酶體(組織蛋白酶D和 E)、腎素 (renin)、蛋白酶 A(proteinase A)及艾滋病病毒 (H IV)蛋白酶等[1]。天冬氨酸蛋白酶抑制劑在食品保健及醫(yī)藥行業(yè)中應用非常廣泛[2],如抑制腫瘤細胞增殖、增強免疫力和抗癌等,對胃潰瘍、降血壓、艾滋病、中風、老年癡呆癥等的治療具有明顯的療效[1]。而化學法合成天冬氨酸蛋白酶抑制劑往往因其藥理毒性和安全性得不到保證(如 H IVPI沙奎那韋可導致脂代謝紊亂綜合癥),所以在食品及醫(yī)藥行業(yè)中的應用受到很大的限制[3],因此從天然產物中開發(fā)此類蛋白酶抑制劑日益受到人們的關注。

云芝深層發(fā)酵易于規(guī)?；?、大量生產,以土豆汁作為培養(yǎng)基具有取材易,成本低,使用安全,雜質相對較少,應用廣泛等優(yōu)點[4]。利用云芝發(fā)酵制備胃蛋白酶抑制劑(天冬氨酸蛋白酶抑制劑的一種),除對胃蛋白酶具有抑制作用外,還可能兼有云芝多糖和云芝糖肽等的活性功能,保證了其應用的安全性,在醫(yī)藥保健及食品添加劑等方面將有很好的應用前景。

本論文對以胃蛋白酶作靶酶從云芝發(fā)酵液中篩選出的一種有較強抑制效果的蛋白酶抑制劑進行了分離純化和部分性質方面的研究,為更好地揭示和開發(fā)其藥理價值和應用潛力奠定了基礎。目前國內外尚無從天然產物中開發(fā)胃蛋白酶抑制劑的報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云芝 (Coriolus versicolor),菌株購自華中農業(yè)大學菌種實驗中心。

DEAE-52離子交換色譜柱 (20 cm×2.2 cm)、Mono Q離子交換色譜柱 (10 cm×0.46 cm)、ACA-54凝膠色譜柱 (80 cm×1.4 cm)購自安法瑪西亞生物技術有限公司;紫外檢測器 (上海滬西儀器廠);示差檢測器串聯(lián)、進口雙針記錄儀 (德國 Hettich公司);胃蛋白酶 (國藥集團化學試劑有限公司);血紅蛋白(上海麗珠東風生物技術有限公司);其余試劑為國產分析純級。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:采用 PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基: 95%土豆汁,5%麩皮,玻璃珠 (30粒/瓶)。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:純土豆汁,玻璃珠(20粒/瓶)。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵產胃蛋白酶抑制劑

活化的菌株接種于純土豆汁培養(yǎng)基 (pH 6.2,1 ×105Pa,20 min),于搖床 180 r/min,28℃培養(yǎng) 120 h后,將發(fā)酵液超聲波細胞破碎,12000 r/min離心20 min,再經大孔樹脂脫色得上清液,透析后用于抑制劑的純化。

1.2.3 胃蛋白酶活力測定

采用常規(guī)蛋白酶測定法[5]。酶活單位定義:在最適條件下,每分鐘分解底物產生 1μg的酪氨酸定義為一個酶活單位,即 1 u。

1.2.4 抑制率計算

抑制率 =(抑制前酶活 -抑制后酶活)/抑制前酶活 ×100%

1.2.5 抑制活力單位定義

在測定胃蛋白酶活力的條件下,定義抑制率每下降 10%為一個抑制活力單位,即 1 U。

1.2.6 蛋白質濃度測定

采用 Lowry法[6],以牛血清白蛋白做標準曲線。

1.2.7 糖濃度測定

采用苯酚-硫酸法[6],以葡萄糖為對照制作標準曲線。

1.2.8 蛋白酶抑制劑的純化

DEAE-52離子交換層析:流動相 A液為 0.02 mol/L的磷酸緩沖液 (pH 6.8),B液為 0.02 mol/L的磷酸緩沖液(含 0.6 mol/L NaCl溶液,pH 6.8)。以A液洗脫 2倍柱床體積后,以 20%B液階段梯度洗脫,超聲破碎的發(fā)酵液離心透析后上樣,流速為1.5 mL/min,進樣量 10 mL。

Mono Q離子交換層析:流動相 A液為 0.02 mol/L的磷酸緩沖液 (pH 6.8),B液為 0.02 mol/L的磷酸緩沖液(含 0.3 mol/L NaCl溶液,pH 6.8)。以A液洗脫 2倍柱床體積后,以 0%B～50%B液線性梯度洗脫 3倍柱床體積,50%B～100%B液線性梯度洗脫 7倍柱床體積,最后以 B液洗脫 3倍柱床體積。流速為 1.5 mL/min,進樣量 2 mL。

UltroGelACA-54凝膠過濾層析:洗脫劑為 0.02 mol/L,pH 6.8的磷酸緩沖液,洗脫速度 0.7 mL/ min,進樣量 3 mL。

1.2.9 抑制劑純度鑒定以及分子量的測定

相對分子質量測定:采用凝膠過濾法[7]。用UltroGelACA-54層析柱。亞基相對分子質量確定:用 SDS-PAGE法[7],分離膠濃度 15%,濃縮膠濃度5%。

1.2.10 胃蛋白酶抑制劑的性質

胃蛋酶抑制劑熱穩(wěn)定性試驗:將抑制劑分別置于 0、20、40、60、80和 100℃的水浴中處理 1 h,考察其在 0～100℃范圍內對胃蛋白酶的抑制效果。

胃蛋白酶抑制劑對底物特異性研究:在 pH 5.0,反應時間為 1 h的條件下,考察抑制劑對不同來源的蛋白酶如胃蛋白酶、Pr A、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的抑制效果,其方法與測定胃蛋白酶活力的方法一致。

對胃蛋白酶半抑制濃度 I C50的測定:在 pH 5.0,反應時間為 1 h的條件下,測定不同濃度的抑制劑對胃蛋白酶的抑制率,將抑制率和其對應的蛋白濃度進行作圖,根據(jù)曲線確定 IC50值。

抑制動力學研究:將抑制劑稀釋到一定的濃度與胃蛋白酶混合,以不同濃度的血紅蛋白作底物進行反應[8]。

2 結果與討論

2.1 胃蛋白酶抑制劑的純化

2.1.1 DEAE-52離子交換層析

將透析后的發(fā)酵液經過 DEAE-52離子交換層析,結果如圖 1,在鹽濃度為 0.2 mol/L時的洗脫峰4、峰 5有抑制活性,取抑制活性較高的峰 5繼續(xù)進行分離純化。

圖1 DEAE-52離子交換層析Fig.1 I on-exchange chromatography on DEAE-52

2.1.2 Mono Q離子交換層析

收集上步的洗脫峰 5,透析濃縮后經過MonoQ離子交換層析 (圖 2),線性洗脫,出現(xiàn)四個洗脫峰,經檢測在鹽濃度為 0.196 mol/L時的洗脫峰Ⅱ有抑制活性。

2.1.3 UltroGelACA-54凝膠過濾層析

將上步有抑制效果的峰Ⅱ濃縮后經過ACA-54,結果出現(xiàn)三個蛋白質峰 (圖 3),經測定峰 c有抑制活性,用苯酚-硫酸法測糖含量,該蛋白質樣品中沒有糖,說明該蛋白不是糖蛋白。

2.2 抑制劑純度鑒定以及分子量的測定

用胰蛋白酶,胃蛋白酶,卵清蛋白,牛血清白蛋白為標準樣品,并以洗脫體積Ve對 lg Mr做圖得UltroGelACA-54分子量標準曲線。由抑制劑的洗脫體積算出其分子量約為 23 kDa。SDS-PAGE鑒定抑制劑為單一條帶,相對分子質量為 22.31 kDa,與凝膠過濾法測定結果基本一致,說明抑制劑為單亞基。

表 1 胃蛋白酶抑制劑的提純結果Table 1 Purification of pepsin inhibitor

2.3 胃蛋白酶抑制劑的性質

2.3.1 抑制劑熱穩(wěn)定性試驗

于 0～100℃的環(huán)境下測定抑制劑的穩(wěn)定性,由圖 5可以看出,此 0～80℃范圍內,抑制率變化穩(wěn)定在 50%～60%之間,表明抑制劑熱穩(wěn)定性良好。

2.3.2 抑制劑對底物的特異性研究

結果如圖 6可知,抑制劑對胃蛋白酶的特異性很強,其次對天冬氨酸族的蛋白酶 A和木瓜蛋白酶也有一定的抑制效果。

2.3.3 抑制劑對胃蛋白酶的半抑制濃度測定

由圖 7可知,抑制劑對胃蛋白酶的半抑制濃度為 29.26μg/mL。從靈芝發(fā)酵全粉中提取得到的蛋白酶抑制劑對胃蛋白酶的半抑制濃度為 180μg/mL[9],表明云芝發(fā)酵產生的胃蛋白酶抑制劑對胃蛋白酶有較強的抑制活性。

圖 4 胃蛋白酶抑制劑的 SDS-PAGE圖譜Fig.4 Graph of SDS-PAGE of pepsin inhibitor

圖 7 抑制劑用量對抑制活性的影響Fig.7 Effect of different inhibitor content on inhibition

2.3.4 抑制劑對胃蛋白酶的抑制動力學研究

用 Lineweaver-Bunk雙倒數(shù)法作圖[8],得圖 8、圖9。

從圖 9結果判斷抑制劑的抑制作用既類似于非競爭性抑制又類似于反競爭性抑制,稱這種抑制類型為非競爭性與反競爭性混合型[10]。根據(jù)Km/Vm ×(1+[I]/Ki)=0.0306,其中[I]=0.97(μmol/ L),求得Ki=0.996(μmol/L)。

3 結語

云芝發(fā)酵液經過分離純化得到電泳純的胃蛋白酶抑制劑,最終蛋白回收率為 3.29%,純化倍數(shù)為35.9。

本文對胃蛋白酶抑制劑的性質進行研究,為其應用開發(fā)奠定理論基礎。因胃蛋白酶抑制劑有很好的臨床應用前景,如可以用于治療胃炎,胃潰瘍等疾病[11],因此對于其具體的結構、作用機理、以及結構與功能之間的關系有待進一步探討。

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4 Kim MH,Park SC,Kim JY,et al.Purification and character

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9 Tian YP(田亞平),Zhang KC(章克昌).Purification and characteristic of proteinase inhibitor GLP IA2 fromGanoderm a lucidumby submerged fermentation.Chrom atography(色譜),2005,2:267-269.

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11 Yu SK(于善凱),Zhang Y(張英),Wu XQ(吳小琴).Nutrient content and biological activity of chrysanthemum.Food Nutr China(中國食物與營養(yǎng)),2002,2:50-51.

Purification and Characterization of Pepsin Inhibitor from Fermentation byCoriolus versicolor

L IU Qi,T IAN Ya-ping＊
The Key Laboratory of Industrial B iotechnology,M inistry of Education,Jiangnan University,W uxi 214122,China

In this study,a kind of pepsin inhibitor produced in liquid state fer mentation byCoriolus versicolorwas pretreated by ultrasonic cell disruption,centrifugation,decolorized by a macroporous resin,and then isolated by DEAE-52, Mono Q ion-exchange chromatography and UltroGelACA-54 gel-filtration.Itwas identified to be a protein and showed a single subunit by the methodsofUltroGelACA-54 gel-filtration and SDS-PAGE,the relative molecularweightwas 22.31 kDa.The purified inhibitor remained stable at the range of 0-80℃,and had specific inhibition to pepsin,the IC50to pepsin was 29.26μg/mL,the inhibitory type was the complex of non-competitive and anti-competitive inhibitorymode,and the Kiwas 0.996μmol/L.

Coriolus versicolor;pepsin inhibitor;purification;chromatography

Q503;Q502;R285

A

1001-6880(2010)04-0647-05

2008-09-25 接受日期:2008-11-06

＊通訊作者 Tel:86-510-85918116;E-mail:yapingtian@hotmail.com