賴群 張立堂 孫彥

CT抗原（cancer-testis antigen）是一類在除睪丸、胎盤等以外的正常組織中幾乎不表達(dá)的抗原，但可在多種腫瘤組織中表達(dá)，目前包括MAGE、BAGE、GAGE、NYESO-1、SSX等44種家族成員的CT抗原被發(fā)現(xiàn)[1]。通過RTPCR及免疫組化方法在肺癌、肝癌、卵巢腫瘤及前列腺癌等多種腫瘤中均表達(dá)CT抗原，同時研究[1]證實CT抗原可在腫瘤患者體內(nèi)誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答。XAGE-1是1999年通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種新的CT抗原，屬于GAGE/PAGE家族，XAGE-1基因定位于Xp11.21-Xp11.22，包括XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c、XAGE-1d四種剪切體，利用RT-PCR及Northern blot發(fā)現(xiàn)XAGE-1基因在Ewing's肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤中表達(dá)[2,3]。本實驗研究XAGE-1四種不同剪接體在肺癌組織中表達(dá)情況并分析其與臨床特點的關(guān)系，為XAGE-1作為肺癌免疫治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選取2008年1月-2009年3月在我院胸外科住院手術(shù)患者85例（男性60例、女性25例，平均年齡56.5歲）；腺癌37例， 鱗癌23例，大細(xì)胞癌15例，小細(xì)胞肺癌10例，所有病例均經(jīng)過病理證實，患者簽署知情同意書。手術(shù)過程中，肺葉或全肺切除后，立即切取腫瘤組織及距腫瘤組織＞5 cm的癌旁組織各3塊，每塊約0.5 g，置入無菌、去RNA酶的凍存管，立即投入液氮中，后轉(zhuǎn)入-80oC冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 組織細(xì)胞RNA提取 取約0.2 g肺癌組織及癌旁組織于液氮中研磨，加入Trizol試劑，提取總RNA，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行提取。所得RNA用DEPC處理過的水溶解，-80oC保存?zhèn)溆谩Ｈ∩倭縍NA在紫外分光光度計260 nm和280 nm下確認(rèn)濃度和純度。

1.2.2 肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549培養(yǎng)與RNA提取 用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)A549細(xì)胞，收集總數(shù)為5×106個細(xì)胞利用Trizol試劑進(jìn)行RNA提取，DEPC處理過的水溶解后-80oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 巢式PCR 采用cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行合成，該試劑盒購自加拿大Fermentas公司，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，所得cDNA在-20oC保存。根據(jù)文獻(xiàn)[2]的方法略有改動進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，在50 μL PCR反應(yīng)體系中包括0.4 μmol/L引物、1.5 mmol/L MgCl2、200 mmol/L dNTP及2.5 U GoldTaq酶，第一輪PCR模板為4.0 μL cDNA，選用外側(cè)引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95oC預(yù)變性5 min，94oC、30 s，60oC、45 s，72oC、60 s，35個循環(huán)，72oC延伸7 min；從第一輪PCR產(chǎn)物中取出1.0 μL作為第二輪PCR模板，反應(yīng)條件為：95oC預(yù)變性5 min，94oC、30 s，58oC、30 s ，72oC、30 s，30個循環(huán)，72oC延伸7 min；同時以GAPDH（PCR產(chǎn)物為138 bp）為內(nèi)參考基因同時進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序分析 每個陽性條帶所對應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序得到的序列利用BLAST程序在GenBank上進(jìn)行序列分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用Fisher's精確概率法及Pearson's chi square檢驗進(jìn)行XAGE-1b基因表達(dá)與臨床及病理特點相關(guān)性分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 XAGE-1基因在肺癌組織中表達(dá)情況 收集85例肺癌組織和癌旁組織，提取RNA后利用巢式PCR檢測XAGE-1四種不同剪接體基因的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分肺癌組織表達(dá)XAGE-1b、XAGE-1d基因，而不表達(dá)XAGE-1a、XAGE-1c基因，A549細(xì)胞系表達(dá)XAGE-1b基因（圖1），PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后與GenBank進(jìn)行序列比對后證實為目的基因，癌旁組織中均不表達(dá)XAGE-1基因。在各種類型肺癌中，59.46%（22/37）的腺癌組織表達(dá)XAGE-1基因 （XAGE-1a 0/37; XAGE-1b 17/37; XAGE-1c 0/37; XAGE-1d 6/37），其中1例腺癌組織同時表達(dá)XAGE-1b與XAGE-1d基因。21.74%（5/23）鱗癌組織表達(dá)XAGE-1基因（XAGE-1a 0/23; XAGE-1b 4/23; XAGE-1c 0/23; XAGE-1d 1/23），15例大細(xì)胞癌組織中僅檢測到2例癌組織表達(dá)XAGE-1b基因，而10例小細(xì)胞癌組織中均未檢測到XAGE-1基因表達(dá)。

2.2 XAGE-1b基因表達(dá)與腺癌、鱗癌臨床特點的關(guān)系 目前研究認(rèn)為XAGE-1b具有較高的免疫原性和較高的表達(dá)率，我們分析了37例腺癌與23例鱗癌組織標(biāo)本XAGE-1b基因的表達(dá)與性別、年齡、病理類型及臨床分期的關(guān)系（表1）。統(tǒng)計結(jié)果表明XAGE-1b基因的表達(dá)與肺癌病理類型有相關(guān)性（P＜0.05），腺癌陽性表達(dá)率明顯高于鱗癌，而與肺癌的性別、年齡及臨床分期無相關(guān)性（P＞0.05）。由于對病例生存期隨訪時間較短，故有待于對病例進(jìn)行繼續(xù)隨訪，以便分析XAGE-1b基因的表達(dá)與患者生存期之間的關(guān)系。

圖 1 XAGE-1基因在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)。1：100 bp DNA ladder；2：A549細(xì)胞系；3：癌旁組織；4、5：腺癌組織；6、7：鱗癌組織；8：大細(xì)胞肺癌組織；9：小細(xì)胞肺癌組織。XAGE-1b、XAGE-1d和GAPDH的PCR產(chǎn)物大小分別為252 bp、169 bp和138 bp。Fig 1 Expression of XAGE-1 gene in lung tumor tissues and adjacent tissues. 1: 100 bp DNA ladder; 2: A549 cell line; 3: tumor adjacent tissue;4, 5: adencarcinoma; 6, 7: squamous cell carcinoma; 8: large cell lung cancer; 9: small cell lung cancer. The sizes of PCR products are 252 bp,169 bp and 138 bp for XAGE-1b, XAGE-1d and GAPDH, respectively.

表 1 XAGE-1b基因表達(dá)與腺癌、鱗癌患者臨床特點的關(guān)系Tab 1 The correlation between XAGE-1b gene expression and several clinical characteristics of adencarcinoma and squamous cell carcinoma

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌占70%-80%，目前手術(shù)及化療效果特別是晚期患者效果不佳，免疫治療是一種新的治療方法，而免疫治療的基礎(chǔ)就是必須尋找特異性表達(dá)的腫瘤抗原。研究證實CT抗原具有較高的免疫原性，可以誘發(fā)機(jī)體的腫瘤特異性的細(xì)胞免疫和/或體液免疫殺傷腫瘤細(xì)胞，同時CT抗原僅在睪丸、胎盤等正常組織中表達(dá)，但在多種腫瘤組織中高表達(dá)，具有較高的腫瘤特異性，因此，CT抗原是腫瘤免疫治療特別是腫瘤疫苗治療的理想靶抗原，以NY-ESO-1、MAGE-A、SSX抗原為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗已進(jìn)入臨床試驗階段[4-6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌組織中也表達(dá)MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-12、NY-ESO-1等多種CT抗原。

XAGE-1是一種在多種腫瘤組織中表達(dá)的CT抗原，通過RT-PCR及Northern blot研究發(fā)現(xiàn)XAGE-1b基因在PC3（前列腺細(xì)胞系）、MDA-MB-231（肺癌細(xì)胞系）、OVCAR（卵巢細(xì)胞系）、FEM-X（黑色素瘤細(xì)胞系）、HUT102（T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系）、U937（組織細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞系）、 A-172（神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系）均有表達(dá)，同時有臨床研究發(fā)現(xiàn)XAGE-1b基因在Ewing's肉瘤、惡性黑色素瘤、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤組織中表達(dá)，在前列腺癌和黑色素瘤的研究中還發(fā)現(xiàn)XAGE-1b基因表達(dá)與腫瘤的臨床分期有關(guān)[2,3]。本研究采用巢式PCR技術(shù)檢測XAGE-1四種不同剪接體在肺癌中表達(dá)情況，結(jié)果顯示32.94%（28/85）肺癌患者癌組織陽性表達(dá)XAGE-1基因，其中27.06%（23/85）肺癌患者癌組織陽性表達(dá)XAGE-1b基因，與國外報道的30.61%（15/49）肺癌患者癌組織陽性表達(dá)XAGE-1b基因略有差異，本研究還檢測了肺癌組織中XAGE-1d基因表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)8.24%（7/85）患者癌組織陽性表達(dá)XAGE-1d基因，低于Nakagawa等[8]報道的表達(dá)陽性率（12.24%, 6/49），可能與病例數(shù)及病理類型組成不同有關(guān)。本研究證實XAGE-1b具有較強(qiáng)的免疫原性和較高的表達(dá)率，本實驗重點分析了XAGE-1b基因的表達(dá)與臨床特點的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)XAGE-1b基因的表達(dá)與肺癌病理類型有相關(guān)性（P＜0.05），腺癌陽性表達(dá)明顯高于鱗癌，與肺癌的性別、年齡及臨床分期無相關(guān)性（P＞0.05），提示在肺腺癌中可以優(yōu)先選擇該基因作為瘤苗及免疫治療靶點。Shimono等[9]鑒定出HLA-DRB1*0410限制的XAGE-1b37-48多肽可以產(chǎn)生XAGE-1b特異性的CD4+T細(xì)胞，Kikuchi等[10]已經(jīng)報道患者在手術(shù)后XAGE-1b可以誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞抗微小殘留病變從而延長患者的存活時間，從而進(jìn)一步為XAGE-1作為腫瘤治療的靶點提供了理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本實驗研究發(fā)現(xiàn)XAGE-1基因在部分肺癌組織陽性表達(dá)，XAGE-1b基因表達(dá)與肺癌病理類型有關(guān)。但目前XAGE-1在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能仍然未知，下一步應(yīng)進(jìn)一步對XAGE-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用進(jìn)行深入研究，以便為XAGE-1作為免疫治療靶點提供理論依據(jù)。