王凱冰 隋紅 李樂靜 李曦 王磊

近年來，應用具有復制能力的溶瘤病毒治療惡性腫瘤備受腫瘤學者的關注[1-5]。新近發(fā)現的新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）D90株具有體外抗腫瘤作用而對人正常組織細胞無毒性[6,7]。新城疫病毒的這種選擇性殺傷腫瘤細胞的特性的具體機制目前尚未闡明。隨著對NDV抗腫瘤機制研究的不斷深入，發(fā)現NDV的包膜糖蛋白血凝素–神經氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase, HN）是NDV抗腫瘤的主要功能性蛋白，是NDV抗腫瘤作用的主要分子基礎[8]。

我們應用合理的生物學技術構建定位表達于細胞漿、細胞膜和細胞外的HN蛋白真核DNA質粒，即胞漿型（Cy-HN）、跨膜型（M-HN）和分泌型（Sc-HN）。前期工作中將構建的三種重組質粒體外轉染肺癌A549細胞系，通過MTT和流式細胞儀方法檢測證實三種重組質粒能夠抑制肺癌A549細胞生長并存在差異，這種差異與跨膜型和分泌型HN蛋白的真核DNA質粒誘導A549細胞產生早期凋亡和晚期壞死的比率增加有關。電鏡下和激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內凋亡小體的存在[9]?；隗w外實驗的初步結論，本研究進一步研究胞漿型、跨膜型和分泌型HN蛋白的真核DNA質粒對荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和重組真核表達質粒構建 人肺癌A549細胞系由哈爾濱獸醫(yī)研究所國家重點實驗室提供，常規(guī)培養(yǎng)（DMEM, Invitrogen, USA; 10%FBS, Invitrogen, USA）。以新城疫病毒D90株全基因為模板，以pcDNA3.1(+)為真核表達載體，構建胞漿型、跨膜型和分泌型DNA質粒并保存于哈爾濱獸醫(yī)研究所國家重點實驗室[10]。

1.2 建立裸小鼠皮下人肺腺癌移植瘤動物模型及瘤內接種步驟 裸小鼠純合子nu/nu BALB/c，雌性，6周齡-7周齡，體重16 g-18 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于哈爾濱獸醫(yī)研究所動物實驗中心屏障環(huán)境。所涉及的動物實驗遵循動物實驗操作規(guī)程。收集3×106個肺癌A549細胞于150 μL PBS溶液（pH7.4）中制成單細胞懸液，接種于裸鼠大腿外側皮下。每間隔2天-3天測量實體瘤的正交直徑。一旦荷瘤在任何經線上達到25 mm，隨機分入5個治療組中：Cy-HN、Sc-HN、M-HN、空載體質粒pcDNA3.1(+)和生理鹽水。分別接受瘤內多點注射重組質粒100 μg。每間隔5天（即d1，d5，d10，d15）注射1次，共4次。所有治療的實驗動物在初次治療后21天處死，除非裸鼠出現嚴重的體重減輕或惡液質。腫瘤體積參考公式: V=（腫瘤最大截面積）3/2[11]。

1.3 脾臟淋巴細胞增殖實驗檢測小鼠細胞免疫功能 無菌取脾臟，制成脾單個核細胞懸液（V脾細胞:VPBS=1:4）。用0.75%Tris-NH4Cl （pH7.4）溶解紅細胞。PBS洗滌3次，用Ficoll-isopaque solution提純淋巴細胞制成單細胞懸液，RPMI-1640重懸并調整細胞密度（1×107個/mL）。平鋪于96孔平板中，100 μL/孔。每孔加入100 μL含有或不含有HN蛋白抗原（5 μg/mL），混勻。實驗孔加入ConA （終濃度5 μg/mL）作為陽性對照，同時設無細胞孔作為調零孔。每孔設3個重復孔。用改良后的Mヰ比色法測定脾臟淋巴細胞增殖指數，即在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入MTS（Promega, USA）20 μL繼續(xù)培養(yǎng)5 h，培養(yǎng)結束前10 min內用酶標儀測定各孔A570值。淋巴細胞增殖指數（stimula- tion index, SI）=（加刺激細胞組OD值-混合淋巴細胞對照孔均OD值）/刺激細胞空白對照組OD值。

1.4 細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）實驗 采用4 h51Cr釋放法[12]：①效應細胞：分離的脾淋巴細胞即為效應細胞CTL。②靶細胞：肺癌細胞A549重懸于不含碳酸氫鈉的完全培養(yǎng)液。加入51Cr鉻酸鈉，37oC水浴中標記1 h，洗滌并調整細胞濃度為2×105/mL。③體外致敏：實驗組和對照組的淋巴細胞和經絲裂霉素C處理的A549細胞置37oC培養(yǎng)96 h。體外致敏的效應細胞經RPMI完全培養(yǎng)液洗滌，重懸。④細胞毒效應：向96孔U型板加入靶細胞，每孔100 μL（2×104/孔）。分別按效應細胞:靶細胞=75:1、50:1和25:1向各孔加入100 μL不同效應細胞。每組均設3個復孔，陰性對照孔（自發(fā)釋放）只加100 μL完全培養(yǎng)液，陽性對照孔（最大釋放）加50 μL Zapoglobin（Beckman Coulter）細胞溶解劑。將96孔板置37oC培養(yǎng)4 h后，800 rpm離心培養(yǎng)板6 min，每孔吸取100 μL上清在液閃計數儀上測定每分鐘放射活性（cpm值）。細胞殺傷活性按以下公式計算：CTL活性（%）=[（實驗組cpm-自發(fā)釋放cpm）/（最大釋放cpm-自發(fā)釋放cpm）]×100%。

1.5 數據分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，所有變量均以Mean±SD表示。變量間差異比較用One-way ANOVA方差分析和Fisher's LSD進行多重比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 細胞定位表達HN蛋白的重組DNA質粒對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 各種重組質粒對荷瘤小鼠腫瘤體積的變化見表1。第9天，瘤內注射M-HN的小鼠腫瘤體積增長緩慢，同瘤內注射空載體pcDNA3.1(+)的相比有統(tǒng)計學差異。第12、15和18天， 瘤內注射生理鹽水組和空載體pcDNA3.1(+)組小鼠腫瘤體積同瘤內注射重組HN質粒組相比有統(tǒng)計學差異。第21天，各組荷瘤小鼠腫瘤體積增長出現明顯差異，瘤內注射生理鹽水組小鼠腫瘤體積最大，其次為空載體pcDNA3.1(+)組、Cy-HN、Sc-HN和M-HN（圖1）。比較第18天和21天荷瘤小鼠腫瘤體積的生長程度，瘤內注射M-HN的荷瘤小鼠腫瘤生長最慢（第18天：P=0.022；第21天：P＜0.01）。

表 1 荷瘤小鼠經不同處理后腫瘤體積變化（n=8, Mean±SD）Tab 1 Variation of tumor size of A549 lung carcinoma tumor (n=8, Mean±SD)

2.2 細胞定位表達HN蛋白的重組DNA質粒對脾淋巴細胞增殖的影響 瘤內注射M-HN的淋巴細胞刺激指數最高，同注射空質粒pcDNA3.1(+)組相比有統(tǒng)計學差異 （2.18 vs 0.87, P=0.003）（圖1）。

圖 1 各組間淋巴細胞刺激指數比較。? 同PC3.1(+)組相比，P＜0.05。Fig 1 Stimulation index in A549 cells transfected with PC3.1(+),Cy-HN, Sc-HN and M-HN. ? indicates significantly different from PC3.1(+)，P＜0.05.

2.3 CTL實驗檢測結果 跨膜型HN蛋白重組DNA質粒誘導的CTL活性最強，同其它各組相比有統(tǒng)計學差異[M-HN vs Cy-HN, P=0.019; M-HN vs Sc-HN, P=0.043; M-HN vs pcDNA3.1(+), P＜0.01]。胞漿型和分泌型HN蛋白重組DNA質粒誘導的CTL活性無統(tǒng)計學差異（P=0.656）（圖2）。

圖 2 細胞毒性T淋巴細胞（CTL）實驗。? 同PC3.1(+)組比較，P＜0.05；? 同M-HN組比較，P＜0.05，a 同E/T比為25:1組，P＜0.05。Fig 2 The CTL activity in tumor-bearing mice treated with PC3.1(+),Cy-HN, Sc-HN and M-HN. ? indicates significantly different from PC3.1(+), P＜0.05; ? denotes significantly different from M-HN, P＜0.05.a indicates significantly different from E/T ratio of 25:1, P＜0.05.

3 討論

目前對新城疫病毒HN蛋白所介導的抗腫瘤機制尚未闡明，可能的機制包括：去除腫瘤細胞表面的唾液酸；增強腫瘤細胞表面的粘附性和腫瘤細胞對淋巴細胞的共刺激作用；促進效應細胞的活化和腫瘤細胞的凋亡。我們設想通過重組病毒結構調整其固有免疫效應來優(yōu)化新城疫病毒所產生的溶瘤作用[13,14]。將NDV的抗腫瘤HN基因進行克隆，以抗腫瘤基因的真核重組體的表達產物取代完整病毒，克服完整病毒所引起的副作用及可能帶來的危險，從而具有非?？煽康陌踩院图毎呙鐭o法比擬的優(yōu)越性。

本研究旨在探討HN蛋白在宿主細胞不同部位表達的免疫原性的不同是否會帶來腫瘤細胞識別和宿主細胞的細胞毒性作用的變化。體外實驗的結果讓我們看到通過重組病毒結構可以改善HN蛋白的抗腫瘤作用[9]。進一步研究通過構建荷瘤小鼠模型，比較3種重組質粒的抗腫瘤作用和免疫機制發(fā)現，瘤內注射跨膜型重組真核表達質粒的荷瘤小鼠腫瘤生長緩慢，與瘤內注射胞漿型和分泌型重組真核表達質粒的荷瘤小鼠相比有統(tǒng)計學差異（第18天：P=0.022；第21天：P＜0.01）。體外再刺激荷瘤小鼠脾淋巴細胞發(fā)現，其淋巴細胞刺激指數在瘤內注射跨膜型HN質粒組最高。應用標準的CTL實驗檢測定位表達HN蛋白的重組DNA質粒誘導的CTL效應，在效靶比（E/T）為75:1時，瘤內注射跨膜型質粒的裸鼠的CTL活性最強，同其它各組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），而胞漿型和分泌型HN蛋白的重組DNA質粒之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

總之，我們的實驗闡明了通過改變蛋白的細胞定位表達，HN蛋白的免疫原性可被顯著提高。雖然本實驗未能提供直接的質粒在體內的作用過程和細胞定位的證據，現有的數據亦不能直接如實反映質粒在荷瘤小鼠內的體內作用過程，但是我們的結果表明跨膜型HN蛋白的抗腫瘤免疫作用明顯高于胞漿型和分泌型，其抗腫瘤作用機制有待進一步闡明。