陳真 陳智偉

肺癌分子靶向治療常用的治療靶點(diǎn)有：細(xì)胞受體、信號(hào)傳導(dǎo)和抗血管生成等，其中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）是目前最為主要的靶點(diǎn)。目前已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準(zhǔn)用于臨床治療的EGFR家族特異性靶向藥物主要分為兩大類：一類是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI），如吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）；另一類是人源化單克隆抗體，如EGFR特異性抗體西妥昔單抗（cetuxmab）和HER2特異性抗體赫賽?。╰rastuzumab）。針對(duì)EGFR進(jìn)行抗腫瘤治療的單克隆抗體可阻斷配體與EGFR的結(jié)合。這些抗體能夠識(shí)別受體的胞外結(jié)構(gòu)域，競爭與配體的結(jié)合位點(diǎn)，抑制EGFR的二聚化并下調(diào)細(xì)胞表面EGFR的數(shù)量[1]。有研究者[2]認(rèn)為EGFRTKI的療效受到腫瘤組織EGFR基因突變的影響，沒有發(fā)生突變的患者可能表現(xiàn)為無效；而EGFR基因突變并不影響EGFR單抗的療效，因此受到人們的關(guān)注。

已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了西妥昔單抗應(yīng)用于肺癌治療的臨床研究，其中不乏III期臨床研究證據(jù)。本研究的目的在于探討運(yùn)用西妥昔單抗對(duì)人肺癌細(xì)胞和增殖的體外抑制作用，對(duì)EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵酶：磷酸化EGFR（p-EGFR）、磷酸化MAPK（p-MAPK）、磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表達(dá)水平的影響，探討其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞株A549、SPC-A-1、H460、H1229購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，西妥昔單抗由德國默克公司提供。小鼠抗erbB-2、c-myc抗體、熒光標(biāo)記的抗小鼠抗體購自北京中山公司?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-CCK-8（cell counting kit-8）購自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 細(xì)胞于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。4株細(xì)胞鋪96孔板，用西妥昔單抗分別以起始濃度1 nmol/L五倍的濃度遞增，進(jìn)行細(xì)胞藥物干預(yù)，同時(shí)設(shè)置好非藥空白對(duì)照。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 通過CCK8實(shí)驗(yàn)法分別測定4株人肺癌細(xì)胞株在不同藥物濃度作用下的抑制率 藥物干預(yù)72 h后分別做CCK8實(shí)驗(yàn)，在每個(gè)孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8試劑。把培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h-4 h。在450 nm波長處測定吸光度，參比波長為600 nm。各藥物濃度3個(gè)重復(fù)，分別求出對(duì)各細(xì)胞的抑制率：腫瘤細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組的吸光度/對(duì)照組的吸光度）×100%，測定各組細(xì)胞72 h增殖抑制情況。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測 對(duì)選定的經(jīng)西妥昔單抗分別作用的A549、SPC-A-1兩株細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀方法檢測經(jīng)西妥昔單抗處理后細(xì)胞所處的分裂周期。干預(yù)72 h后觀察并對(duì)3組細(xì)胞狀態(tài)顯微拍照， 碘化吡啶（PI）標(biāo)記細(xì)胞凋亡情況，各組各藥濃度做一次PI凋亡流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測 收集細(xì)胞，根據(jù)凋亡和遷移能力程度的改變，檢測相應(yīng)的信號(hào)通路蛋白分子在蛋白水平的變化。Western blot檢測SPC-A-1細(xì)胞信號(hào)通路蛋白相應(yīng)的磷酸化蛋白p-AKT、p-EGFR、p-MAPK的表達(dá)，以β-actin的水平作為等量蛋白質(zhì)上樣，對(duì)照空白對(duì)照組，每個(gè)樣本重復(fù)3遍。取50 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上；室溫封閉2 h后，用含0.05%Tween220的TBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)的單克隆抗體1:800，4oC孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1:5 000，37oC搖床溫育2 h，ECL顯色系統(tǒng)顯色。最后經(jīng)ECL系統(tǒng)曝光顯影，通過凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)使用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度西妥昔單抗對(duì)A549、SPC-A-1、H460、H1229細(xì)胞株增殖的抑制 在藥物作用下，4種細(xì)胞株的增殖均有下降，受到明顯的抑制，并隨著藥物濃度的增高抑制效果增強(qiáng)（圖1）。

2.2 不同濃度西妥昔單抗對(duì)A549、SPC-A-1、H460、H1229細(xì)胞株凋亡的影響 藥物處理細(xì)胞后，多數(shù)細(xì)胞被阻斷于G1期，并隨著藥物濃度的增加被阻斷于G1期的細(xì)胞增多。藥物連續(xù)處理細(xì)胞株后，藥物組細(xì)胞的凋亡率也均高于空白對(duì)照組（圖2）。

2.3 西妥昔單抗作用對(duì)EGFR信號(hào)通路蛋白的影響 虞永峰等[3]發(fā)現(xiàn)SPC-A-1細(xì)胞株EGFR表達(dá)情況較好。我們選擇Western blot檢測SPC-A-1細(xì)胞信號(hào)通路蛋白相應(yīng)的磷酸化蛋白p-AKT、p-EGFR、p-MAPK的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，西妥昔單抗作用SPC-A-1可明顯降低p-AKT、p-EGFR、p-MAPK蛋白表達(dá)水平，藥物作用與肺癌細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)抑制明顯相關(guān)（P＜0.001）（圖3）。

3 討論

西妥昔單抗是一個(gè)特異性針對(duì)EGFR的IgG1單克隆抗體，與非活化的EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，且親和力遠(yuǎn)高于內(nèi)源性配體，可以競爭性阻斷配體與受體的結(jié)合，從而阻斷內(nèi)源性配體介導(dǎo)的EGFR酪氨酸激酶活化[4]。目前大量臨床研究[5-8]已證實(shí)西妥昔單抗在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌以及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中療效確切。

單克隆抗體西妥昔單抗在肺癌治療中的運(yùn)用越來越廣泛。2008年美國臨床腫瘤年會(huì)中報(bào)道的FLEX III期隨機(jī)對(duì)照研究[9]顯示，西妥昔單抗聯(lián)合化療一線治療晚期NSCLC可以顯著延長各病理類型患者的中位生存期（11.3個(gè)月 vs 10.1個(gè)月）與1年生存率（47% vs 42%）。FLEX試驗(yàn)是第一個(gè)證明EGFR抑制劑靶向藥物與化療聯(lián)用可以延長生存的臨床研究，目前被2009版NCCN指南推薦作為晚期NSCLC患者的一線治療。

圖 1 西妥昔單抗作用后對(duì)各細(xì)胞株（A549、H460、H1299、SPC-A-1、95C和95D）的增殖抑制結(jié)果Fig 1 The inhibitory effects of cetuximab on proliferation of human lung cancer cells (A549, H1299, SPC-A-1, H460, 95C and 95D) treated by different concentrations of cetuximab

圖 2 西妥昔單抗作用后A549和SPC-A-1細(xì)胞凋亡圖。A：西妥昔單抗作用后A549細(xì)胞凋亡圖；B：西妥昔單抗作用后SPC-A-1細(xì)胞凋亡圖。Fig 2 The apoptosis rates of A549 and SPC-A-1 cells treated with cetuximab. A:The apoptosis rate of A549 cells treated with cetuximab; B: The apoptosis rate of SPC-A-1 cells treated with cetuximab.

圖 3 西妥昔單抗作用后SPC-A-1細(xì)胞p-AKT、p-EGFR、p-MAPK的表達(dá)下調(diào)。A：西妥昔單抗作用后SPC-A-1細(xì)胞p-AKT、p-EGFR、p-MAPK的Western blot電泳圖，以β-actin為內(nèi)對(duì)照；B：直方圖顯示西妥昔單抗作用SPC-A-1能明顯降低p-AKT、p-EGFR、p-MAPK蛋白表達(dá)水平。*P＜0.05。Fig 3 The expressions of p-AKT, p-EGFR, p-MAPK were downregulated in SPC-A-1 cell treated with cetuximab. A: The Western blot images of p-AKT, p-EGFR, p-MAPK in SPC-A-1 treated with cetuximab. β-actin served as internal control; B: The expressions of p-AKT, p-EGFR, p-MAPK were reduced significantly by cetuximab in SPC-A-1 cells than internal control. *P＜0.05.

西妥昔單抗作用機(jī)制為：與EGF、TGF等配體競爭EGFR分子上的特殊結(jié)合位點(diǎn)，阻斷配體對(duì)受體的激動(dòng)作用，并通過EGFR的內(nèi)吞、失活，下調(diào)其在胞膜的表達(dá)水平，還可激活抗體依賴的細(xì)胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC），產(chǎn)生進(jìn)一步的細(xì)胞殺傷效應(yīng)[10]。本研究結(jié)果顯示西妥昔單抗對(duì)4株細(xì)胞株都表現(xiàn)出一定的體外增殖抑制作用，其抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性。隨著作用時(shí)間的延長，其對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。

我們采用Westem blot法檢測經(jīng)西妥昔單抗處理SPC-A-1可明顯降低p-AKT、p-EGFR、p-MAPK蛋白表達(dá)水平，藥物作用與肺癌細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)抑制明顯相關(guān)進(jìn)一步下調(diào)了其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中活化的關(guān)鍵酶蛋白的表達(dá)，從而體現(xiàn)了明顯的作用。

在人肺癌細(xì)胞系的體外作用中，西妥昔單抗具有一定的抑瘤效應(yīng)，其作用的分子機(jī)制是進(jìn)一步下調(diào)了活化的EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵酶的表達(dá)，這為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究、臨床用藥提供了一定的指導(dǎo)作用。EGFR單克隆抗體靶向治療肺癌具有良好的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步的研究。