孫書(shū)勤,王江濤＊＊,孫寶維,鄭 宇,孫銘一,2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266100;2.美國(guó)佐治亞大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院,佐治亞30602-3636)

5種海洋微藻細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成分析

孫書(shū)勤1,王江濤1＊＊,孫寶維1,鄭 宇1,孫銘一1,2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266100;2.美國(guó)佐治亞大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院,佐治亞30602-3636)

對(duì)5種海洋微藻的脂肪酸組成進(jìn)行了研究。微藻在確定的條件下生長(zhǎng),分別于指數(shù)生長(zhǎng)前期和穩(wěn)定期后期,測(cè)定其脂肪酸組成。根據(jù)細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)脂肪酸極性差別,采用硅膠柱層析法分離脂肪酸,應(yīng)用GC與GC-MS進(jìn)行定量與定性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在微藻生長(zhǎng)的不同時(shí)期,細(xì)胞內(nèi)脂與細(xì)胞膜脂含量及各自的脂肪酸組成明顯不同;無(wú)論是指數(shù)生長(zhǎng)前期還是穩(wěn)定期后期,胞內(nèi)物質(zhì)的脂肪酸含量明顯要低于細(xì)胞膜組分,細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞膜中主要組成是C16系與C18系脂肪酸。

海洋微藻;細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸;脂肪酸組成

海洋浮游植物承擔(dān)著目前地球上光合作用的一半任務(wù),對(duì)大氣CO2濃度和全球碳循環(huán)有重要的調(diào)控作用[1]。浮游植物是海洋系統(tǒng)有機(jī)物的主要生產(chǎn)者,為浮游和底棲群落提供食物和能量;一部分浮游植物產(chǎn)生的有機(jī)物(包括脂類(lèi)化合物)被保存在海洋沉積物中,既是全球碳收支中有機(jī)碳的主要組分,又作為生命活動(dòng)和環(huán)境變遷的記錄,提供地球歷史演變的重要信息。浮游植物通過(guò)光合作用合成多種脂類(lèi)化合物,可以占到生物量總碳的5%～20%[2]。由于脂類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)具有指紋特征,并較之蛋白質(zhì)和糖類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[2],作為一種生物標(biāo)記物,已經(jīng)被廣泛地用于研究有機(jī)物的生物地球化學(xué)循環(huán)和沉積物歷史記錄的反演[3-5]。

脂肪酸是浮游藻類(lèi)活體細(xì)胞生物合成的一類(lèi)重要的脂類(lèi)化合物,(它在細(xì)胞中一般與一些大分子結(jié)合為復(fù)合物,如磷脂與三酰甘油等[6],這些化合物在浮游藻類(lèi)細(xì)胞體內(nèi)具有重要的生物學(xué)功能,它們不僅參與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),而且是細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存能量的物質(zhì)和一些代謝過(guò)程的前體。磷脂是細(xì)胞膜的主要成分,盡管它們的脂?；M成可能發(fā)生顯著變化[7],但在不同的生長(zhǎng)期其含量相對(duì)穩(wěn)定。三酰甘油是浮游藻類(lèi)細(xì)胞內(nèi)的主要能量?jī)?chǔ)存物質(zhì),用于細(xì)胞的新陳代謝[8-9],這些用于能量?jī)?chǔ)存的物質(zhì)主要在藻類(lèi)生長(zhǎng)的穩(wěn)定期合成[10]。由于細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的作用不同,導(dǎo)致它們?cè)诘厍蚧瘜W(xué)沉積保存過(guò)程中也存在差別[11]。本文就五種海洋微藻的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸在不同生長(zhǎng)期的組成進(jìn)行了初步研究比較,以期為脂類(lèi)化合物作為生物標(biāo)記物的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種的來(lái)源

所有藻種均來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù),種類(lèi)如下:

表1 實(shí)驗(yàn)藻種名稱(chēng)Table 1 List of the species of microalgae

1.2 微藻的培養(yǎng)

5種微藻分別培養(yǎng)于500 mL三角瓶中,平行雙樣。培養(yǎng)液按f/2配方[12]配制,在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。光照強(qiáng)度為4 000 lx,光暗周期是12/12,溫度為20.5℃。微藻細(xì)胞數(shù)用血球計(jì)數(shù)板顯微計(jì)數(shù),并在指數(shù)生長(zhǎng)前期及達(dá)到穩(wěn)定期2周后取一定量藻液,過(guò)濾留膜,冷凍保存。

1.3 脂肪酸的提取與分析

參照Sun等人[13]的方法提取總脂肪酸,然后根據(jù)極性差別,按照Ding[11]的方法采用硅膠層析分離出細(xì)胞內(nèi)脂(主要是三酰甘油,屬于中性脂)與細(xì)胞膜脂(主要是磷脂,屬于極性脂)。用Agilent 6890N氣相色譜儀(帶有Agilent-B.01.01C工作站)與Agilent 6890N/ 5973B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)樣品做定量與定性分析。

GC分析條件:FID檢測(cè)器溫度300℃,無(wú)分流進(jìn)樣口溫度300℃,進(jìn)樣量1μL,高純N2做載氣,載氣流速1 mL/min,HP-5色譜柱。

MS條件:離子化方式EI(70 ev),采集方式掃描(scan),He做載氣,流速1 mL/min,無(wú)分流進(jìn)樣口溫度100℃,離子源溫度200℃,EMV為300 V,進(jìn)樣口溫度:250℃,接口溫度:250℃。

升溫程序:

2 結(jié)果

每個(gè)藻種2個(gè)平行組的結(jié)果取平均值后分析,其生長(zhǎng)曲線(xiàn)及取樣時(shí)間如圖1。從圖中可以看出,5種微藻在培養(yǎng)的最初幾天細(xì)胞數(shù)明顯增加,青島大扁藻在培養(yǎng)16 d后進(jìn)入穩(wěn)定期,鹽藻在培養(yǎng)12 d后進(jìn)入穩(wěn)定期,塔瑪亞里山大藻在18 d后進(jìn)入穩(wěn)定期,三角褐指藻和聚球藻則在培養(yǎng)9 d后達(dá)到穩(wěn)定期。在培養(yǎng)的第3天取藻液作為指數(shù)生長(zhǎng)前期樣品(塔瑪亞里山大藻除外,在第12天取藻液),在進(jìn)入穩(wěn)定期2周左右取藻液作為穩(wěn)定期樣品。

圖1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)及取樣時(shí)間Fig.1 The growth curve and the harvest days

2.1 不同生長(zhǎng)時(shí)期脂肪酸分布

如圖2所示,在微藻生長(zhǎng)的不同時(shí)期,細(xì)胞內(nèi)脂、中間產(chǎn)物、細(xì)胞膜脂含量(見(jiàn)表2)及各自的脂肪酸組成明顯不同,不同的微藻差別較大。

表2 不同生長(zhǎng)時(shí)期5種微藻各組分脂肪酸(占總脂肪酸含量的百分比)Table 2 Fatty acids composition of five marine microalgae during different growth phases(%of total FA content)

圖2 5種海洋微藻不同生長(zhǎng)時(shí)期細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸組成(占總脂肪酸含量的百分比)Fig.2 Fatty acids composition(percentage of total fatty acids)in membrane and intracellular components of five marine microalgae during different growth phases

2.1.1 指數(shù)生長(zhǎng)前期脂肪酸分布 由圖2可知,5種海洋微藻在指數(shù)生長(zhǎng)前期脂類(lèi)組成主要是以細(xì)胞膜脂為主,其中尤以16∶0和18∶0 2種飽和脂肪酸為主, 16∶0含量最高。而14∶0在多種微藻中也可檢出,但含量相對(duì)較低。細(xì)胞內(nèi)脂含量較低,種類(lèi)較少,主要也是以16∶0和18∶0 2種飽和脂肪酸為主,16∶0含量最高。細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸種類(lèi)較少。

指數(shù)生長(zhǎng)前期的青島大扁藻,主要的細(xì)胞膜脂肪酸包括16∶0(39.01%),18∶0(25.48%),少量的14∶0與18∶2。細(xì)胞內(nèi)組分包含3種飽和脂肪酸14∶0,16∶0,18∶0但含量都不高。在細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)都檢出了多不飽和脂肪酸22∶6。

指數(shù)生長(zhǎng)前期的鹽藻,細(xì)胞膜中16∶0,18∶1,18∶0在總脂肪酸中的比例接近60%;還檢出2種多不飽和脂肪酸16∶2與18∶2,但含量較低。細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量為19.77%,種類(lèi)較少,僅含有3種飽和脂肪酸14∶0,16∶0,18∶0。

塔瑪亞歷山大藻在指數(shù)生長(zhǎng)前期細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成相似,都是以短鏈飽和脂肪酸為主,16∶0, 18∶0含量較多,不飽和脂肪酸主要是C18系脂肪酸。在細(xì)胞膜中檢出14∶0,但含量極少(0.52%)。

指數(shù)生長(zhǎng)前期的三角褐指藻,相對(duì)于前3種藻,細(xì)胞膜脂含量較低,而細(xì)胞內(nèi)脂含量較高(見(jiàn)表1)。細(xì)胞膜脂肪酸包括較多的16∶0(25%)與18∶0(10.64%)以及少量的14∶0與20∶5。細(xì)胞內(nèi)除3種飽和脂肪酸14∶0,16∶0,18∶0外,還發(fā)現(xiàn)少量多不飽和脂肪酸18∶2。

指數(shù)生長(zhǎng)前期的聚球藻,細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸都是以16∶0與18∶0為主,以及少量的14∶0。細(xì)胞膜中檢出3種不飽和脂肪酸16∶1,18∶2,20∶5,其中20∶5含量最高(5.94%)。細(xì)胞內(nèi)僅包括1種多不飽和脂肪酸18∶2。

2.1.2 穩(wěn)定期后期脂肪酸分布 進(jìn)入穩(wěn)定期后期,5種微藻體內(nèi)脂肪酸組成較指數(shù)生長(zhǎng)前期有一定差異,不飽和脂肪酸種類(lèi)明顯增多。經(jīng)過(guò)硅膠層析后,我們發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定期藻體細(xì)胞膜脂以16∶0及C18系脂肪酸為主,其中16∶0,18∶1含量較高,18∶0相對(duì)較低。微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的相對(duì)含量明顯增高。

青島大扁藻在穩(wěn)定期后期細(xì)胞膜脂肪酸的含量略高于指數(shù)生長(zhǎng)前期,占總脂肪酸的87.36%(見(jiàn)表1),細(xì)胞膜脂肪酸含量從高到低依次為18∶1,16∶0,16∶1,還包括少量18∶0與16∶2,而該藻體在指數(shù)生長(zhǎng)前期細(xì)胞膜中含量最高組分為16∶0。細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量低于指數(shù)生長(zhǎng)前期,未檢出16∶2,其余脂肪酸與細(xì)胞膜組分相同,但含量都很少。在細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)都檢出長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸20∶5與22∶6。

穩(wěn)定期后期的鹽藻,細(xì)胞膜中主要脂肪酸含量從多到少依次為包括18∶1,16∶0,16∶1,18∶0,多不飽和脂肪酸20∶5(4.4%)與18∶2(4.24%)含量相對(duì)較高。細(xì)胞內(nèi)脂肪酸以16∶0與18∶1為主。

塔瑪亞歷山大藻在穩(wěn)定期后期細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸種類(lèi)相同,各自含量較指數(shù)生長(zhǎng)前期都有所增加。相對(duì)于前3種藻,塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞膜中14∶0含量較多。細(xì)胞膜中16∶0含量最高(25.47%);從圖2可以看出,隨不飽和度降低,細(xì)胞膜中C18系列脂肪酸濃度依次降低;長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸20∶5與22∶6含量相對(duì)較高,都在9%左右。細(xì)胞內(nèi)主要脂肪酸含量從高到低依次為16∶0,18∶1,18∶0,其余組分含量很少。

穩(wěn)定期后期三角褐指藻細(xì)胞膜脂主要以16∶0 (43.03%)為主,其含量遠(yuǎn)高于其他組分。而細(xì)胞內(nèi)含量最高的脂肪酸為16∶1(14.07%),16∶0次之(8.54%)。細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)18∶0含量都較各自在指數(shù)生長(zhǎng)前期同種物質(zhì)的含量有所降低。

聚球藻在穩(wěn)定期后期的細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量遠(yuǎn)高于指數(shù)生長(zhǎng)前期,達(dá)到總脂肪酸比例的60.07%,其中16∶0比例最高,其它脂肪酸含量均低于5%。主要細(xì)胞膜脂肪酸包括16∶0與20∶5,而該藻指數(shù)生長(zhǎng)前期細(xì)胞膜中除16∶0與20∶5外,還含有一定量的18∶0。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)5種海洋微藻細(xì)胞的脂類(lèi)化合物進(jìn)行硅膠層析,分離出細(xì)胞膜脂類(lèi)和胞內(nèi)物質(zhì),分別比較了不同生長(zhǎng)階段二者間的脂肪酸組成異同。

比較指數(shù)生長(zhǎng)前期的五種微藻可以發(fā)現(xiàn):鹽藻、三角褐指藻與聚球藻不飽和脂肪酸種類(lèi)以及含量相對(duì)其他2種藻較高;5種藻體內(nèi)大部分不飽和脂肪酸都存在于細(xì)胞膜上,這說(shuō)明在指數(shù)生長(zhǎng)前期不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成物質(zhì)之一。細(xì)胞膜組分的脂肪酸種類(lèi)要多于胞內(nèi)物質(zhì);2種組分在指數(shù)生長(zhǎng)前期均以飽和脂肪酸為主,不飽和脂肪酸種類(lèi)及含量都相對(duì)較少。

進(jìn)入穩(wěn)定期后期,5種微藻體內(nèi)脂肪酸種類(lèi)明顯增多,組成較指數(shù)生長(zhǎng)前期有一定差異,不飽和脂肪酸種類(lèi)明顯增多。藻體細(xì)胞膜中以16∶0及C18系脂肪酸為主,其中,大多數(shù)微藻以16∶0與18∶1含量較高。細(xì)胞內(nèi)脂中不飽和脂肪酸濃度要高于飽和脂肪酸,但胞內(nèi)物質(zhì)的脂肪酸整體濃度分布仍要低于細(xì)胞膜脂類(lèi)。

通過(guò)比較不同組分、不同生長(zhǎng)時(shí)期的脂肪酸組成與含量我們發(fā)現(xiàn):細(xì)胞膜脂(極性脂)一般為這5種微藻的主要脂類(lèi),是長(zhǎng)鏈多元不飽和脂肪酸(如20∶5, 22∶6)的主要提供者,細(xì)胞內(nèi)脂(中性脂)含短鏈脂肪酸較多(如C16系與C18系脂肪酸),為主要的儲(chǔ)存脂類(lèi),這與俞建江等[14]的研究結(jié)果一致。另外,對(duì)于塔瑪亞歷山大藻、三角褐指藻與聚球藻,這3種藻細(xì)胞內(nèi)脂(中性脂)的含量在穩(wěn)定期高于指數(shù)生長(zhǎng)前期,塔瑪亞歷山大藻、三角褐指藻中細(xì)胞膜脂的含量比較穩(wěn)定,但聚球藻中細(xì)胞膜脂在穩(wěn)定期略有下降,這與魏東等[15]對(duì)后棘藻(Ellipsoidionsp.)與眼點(diǎn)擬微綠球藻(N annochloropsis oculata)的研究結(jié)果有一定的相似性。此外Emdadi等[16]、Dunstan等[10]也報(bào)道指出,中性脂(主要是三酰甘油)在穩(wěn)定期積累[17]。因?yàn)榧?xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后,培養(yǎng)基中氨基酸合成所必需的氮減少,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成量降低,光合作用所同化的碳進(jìn)入到碳水化合物和脂肪(多為三酰甘油)中,出現(xiàn)能量積累的趨勢(shì)[7,18]。

此外,由圖2可以看出,對(duì)于細(xì)胞內(nèi)組分,青島大扁藻與鹽藻中14∶0,16∶0,18∶0,塔瑪亞歷山大藻與三角褐指藻中16∶0,18∶0,18∶2在指數(shù)生長(zhǎng)前期的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其穩(wěn)定期含量。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,微藻為了生存需要,在新陳代謝過(guò)程中會(huì)利用部分脂類(lèi)化合物形成儲(chǔ)能物質(zhì),在環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)元素缺乏或光缺乏的條件下,為了維持自身生長(zhǎng)需要,這部分物質(zhì)的含量會(huì)隨藻類(lèi)的生長(zhǎng)及環(huán)境變化而變化[19]。本實(shí)驗(yàn)采用一次培養(yǎng)過(guò)程,只添加一次營(yíng)養(yǎng)鹽,藻類(lèi)會(huì)在營(yíng)養(yǎng)缺乏的后期,消耗體內(nèi)的儲(chǔ)能物質(zhì),造成部分脂肪酸的減少,故說(shuō)明上述幾種在穩(wěn)定期后期含量減少的脂肪酸是各種藻體內(nèi)儲(chǔ)存能量物質(zhì)的組分。

總的來(lái)說(shuō),在微藻生長(zhǎng)的不同時(shí)期,細(xì)胞內(nèi)脂、中間產(chǎn)物、細(xì)胞膜脂含量及各自的脂肪酸組成明顯不同,不同的微藻差別較大。無(wú)論是指數(shù)生長(zhǎng)前期還是穩(wěn)定期后期,胞內(nèi)物質(zhì)的脂肪酸含量明顯要低于細(xì)胞膜組分,細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞膜中主要組成是C16系與C18系脂肪酸。

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Abstract: To examine composition of algal fatty acids,five marine microalgae were cultured and harvested at logarithmic and stationary phases.Their membrane and intracellular fatty acids were separated by silica gel column due to the polarity.Quantification and identification of fatty acids were performed on GC and GC-MS.Experimental results showed that the composition and concentration of membrane and intracellular fatty acids were apparently different during the two growth phases.Content of intracellular fatty acids were lower than that of membrane composition at both growth stage,C16and C18fatty acids were dominated composition in membrane and intracellular components.

Key words: marine microalgae;membrane and intracellular fatty acids;fatty acid composition

責(zé)任編輯 徐 環(huán)

The Fatty Acid Composition in Membrane and Intracellular Components of Five Species of Marine Microalgae

SUN Shu-Qin1,WAN GJiang-Tao1,SUN Bao-Wei1,ZHENG Yu1,SUN Ming-Yi1,2
(1.Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266100,China;2.Department of Marine Sciences,University of Georgia,Athens,GA 30602-3636,USA)

P736.4

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-191-06

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2001CB409703);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA09Z176);中國(guó)海洋大學(xué)綠卡教授項(xiàng)目資助

2009-03-06;

2009-11-04

孫書(shū)勤(1983-),女,碩士生。E-mail:sqsun1983@hotmail.com

E-mail:jtwang@ouc.edu.cn