孫開明,唐學(xué)璽,張?zhí)煊?李 偉,＊＊

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系,山東泰安271018)

砂生小樹狀霉與鹽水小樹狀霉分類地位初探

孫開明1,唐學(xué)璽1,張?zhí)煊?,李 偉1,2＊＊

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系,山東泰安271018)

從海帶幼孢子體上分離獲得1株海洋真菌(編號OUCMBI080016),根據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定為砂生小樹狀霉(Dendryphiella arenaria)為中國新記錄種。同時,為確定D.arenaria和D.salina的分類地位,從GenBank數(shù)據(jù)庫選取7株齒梗孢屬(Scolecobasidium)和10株小樹狀霉屬(Dendry phiella)菌株(其中7株分離自海洋環(huán)境),進行ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。Kimura雙參數(shù)距離、歧異指數(shù)及MP樹分析顯示,Solecobasidium和Dendryphiella存在較大的遺傳進化差異,研究結(jié)果支持D.arenaria和D.salina屬于Dendryphiella。

海洋真菌;Dendryphiella arenaria;Scolecobasium;ITS

小樹狀霉屬Dendry phiellaBubak&Ranogevic建立于1914年,模式種為葡酒色小樹狀霉Dendry phiella visona(Berk.&M.A.Curt.)Reisinger[1]。此屬目前共報道13種[2],國內(nèi)僅記錄1種:構(gòu)樹小樹狀霉Dendry phiella broussonetiaeY.L.Guo&Z.Y. Zhang[3]。該屬中的砂生小樹狀霉Dendry phiella arenariaNicot和鹽水小樹狀霉Dendry phiella salina (G.K.Sutherl.)Pugh&Nicot被認(rèn)為是專性海洋真菌。這兩種真菌在世界各地分布廣泛,作為分解者存在于海洋環(huán)境中[4]。前者通常分離于海砂中,后者則常見于腐爛的海藻和海草上[1,5-7]。這2種海洋真菌的生境并不僅局限于海砂與海草或海藻,Koehn和Garrison[8]從紅樹植物A vicennia germinans上分離到D. arenaria,Gessner和Goos[9]從米草屬植物S partina alternif loras上分離到上述2種海洋真菌。Edwards等[10]和Edison等[11]分別討論了D.arenaria和D.salina對不同氮源和碳源的利用情況,揭示了D.arenaria和D.salina在海洋碳循環(huán)與氮循環(huán)的過程中可能扮演著重要的角色。

Dendry phiella中海洋真菌D.arenaria和D. salina的分類地位一直存在爭議。Ellis[12]將這兩種真菌劃歸到齒梗孢屬Scolecobasidium中,荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)將D.arenaria和D.salina作為砂生齒梗孢Scolecobasidium arenarium和鹽水齒梗孢Scolecobasidium salinum的異名。目前,一些研究從形態(tài)學(xué)的角度分析了D.arenaria和D.salina與Scolecobasidium的不同[1,5-7],但都沒有對其進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

作者從煙臺海帶養(yǎng)殖廠的日本真海帶L aminaria japonica幼孢子體表面分離獲得了1株海洋真菌,基于其形態(tài)學(xué)特征,將該菌株鑒定為D.arenaria。同時,為探討D.arenaria和D.salina的分類學(xué)地位,基于ITS區(qū)序列,本文將其與Scolecobasidium物種的進化關(guān)系進行了詳細(xì)的分析。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離

在超凈工作臺內(nèi),用無菌海水將海帶幼孢子體沖洗干凈,剪成約2 cm×1 cm的小塊,表面貼于海水PDA培養(yǎng)基(含1 g/L的青霉素G和鏈霉素混合液)上,于20℃暗處培養(yǎng)1～2 d。從培養(yǎng)基中移除孢子體小塊,繼續(xù)在上述條件下培養(yǎng)至有少量菌絲出現(xiàn)。挑取菌落邊緣少量菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基上進行純化,將純化的單一菌株斜面保種并編號。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

純化后的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周,體視鏡下挑取少量菌絲體于載玻片上,以乳酚油為浮載劑。玻片于顯微鏡下拍照,所有顯微照片均經(jīng)過best fit equalization處理,Image-Pro plus 6.0測量孢子大小。

1.3 分子生物學(xué)鑒定與進化分析

1.3.1 DNA提取與ITS片段擴增 DNA提取采用CTAB法[13]。擴增引物選用ITS1和ITS4,擴增片段為ITS1,ITS2和5.8S rDNA[14]。PCR體系為50μL:模板2μL,上游引物ITS1(25μmol/L)和下游引物ITS4(25μmol/L)各1μL,dNTP(2.5μmol/L)4μL, 10×Buffer(含Mg2+)5μL,Taq酶(5 U/μL)0.5μL,雙蒸水定容。擴增程序為:首先,94℃預(yù)變性2 min;然后,94℃變性1 min,55℃退火1.5 min,72℃延伸2.5 min,35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術(shù)有服務(wù)限公司純化后測序。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理與分析 將獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比較,選取相似度最高的序列。同時,從GenBank中下載7株Scolecobasidium與10株Dendry phiella的ITS序列,以Clustal X 1.83進行多序列比對,Bioedit對序列進行手動編輯后,以Mega 4.0中最簡約法(Maximum parsimony,MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展法(Bootstrap)1000次重復(fù)。利用Mega 4.0進行數(shù)據(jù)分析:基于Kimura雙參數(shù)模型計算別計算遺傳距離,以歧異指數(shù)(disparity index)來檢測堿基替換同質(zhì)性[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

砂生小樹狀霉 中國新記錄種(見圖1)

Dendry phiella arenariaNicot,Rev Mycol.Paris 23:93,1958

≡Scolecobasidium arenarium(Nicot)M.B.Ellis,More Dematiaceous Hy phomycetes(Kew):194, 1976.

圖1 砂生小樹狀霉Fig.1 Dendryphiella arenaria

純化后單一菌株在海水PDA上20℃暗培養(yǎng)5 d,菌落呈淺黃綠色,直徑為3～4 cm;菌絲體部分表生,部分埋生;氣生菌絲較發(fā)達;菌絲淡褐色或無色,有隔膜;分生孢子梗內(nèi)壁芽生式產(chǎn)孢,闊線型,頂側(cè)生,長15～31μm,寬2～3μm,淡褐色,簡單或二叉分支,分支處間隔15～21μm,頂端膨大,0-1橫隔膜;產(chǎn)孢細(xì)胞頂生,亞球形,3～4μm;分生孢子單生,頂側(cè)生,10～29μm×5～7 μm,淺褐色或近無色,光滑,棒狀,橢圓形或長橢圓形,直立或稍有彎曲,0～3橫隔,多平行,偶見4～6個橫隔膜,橫隔膜處孢子稍微縊縮或不縊縮,偶有傾斜,分生孢子基部有一個明顯的臍突。

研究菌株:OUCMBI080016,分離自煙臺海帶養(yǎng)殖廠的日本真海帶幼孢子體表面,保存于中國海洋大學(xué)生態(tài)學(xué)實驗室。

2.2 基于ITS區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過序列比對,所得菌株ITS區(qū)序列與D.arenariaCBS 181.58(Genbank登錄號為DQ411539)菌株相似度達99%。經(jīng)Clustal X 1.83比對與Bioedit調(diào)整后,所得菌株ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列與D.arenariaCBS 181.58僅存在1個缺失位點,可認(rèn)為是同一種菌,GenBank登錄號為GU395991。共有592個位點用于系統(tǒng)發(fā)育分析。其中可變位點(Variable sites)362個,簡約信息位點(Parsimony informative sites)263個,保守位點(Conserved sites)219個。進化樹樹長(Tree length)為755,簡約信息位點一致性指數(shù)(Consistency index,CI)為0.751987,保留指數(shù)(Reten-tion index,RI)為0.863993,調(diào)整保留指數(shù)(Rescaled consistency index,RCI)為0.649712。從進化樹(見圖2)上可以看出,以點狀小球殼菌Mycosphaerella punctif ormis為外群(outgroup),Dendry phiella(Ⅰ)和Scolecobasidium(Ⅱ)發(fā)展成2個獨立的類群,Dendryphiella屬的模式種D.vinosa首先分化出來,但支持率不高,僅為67%。海洋真菌D.arenaria和D.salina聚合為1枝,支持率為99%。Scolecobasidium中大部分物種的分支長度要長于Dendry phiella。

圖2 Dendry phiella和Scolecobasidium屬ITS序列的MP進化樹Fig.2 Maximum parsimony(MP)tree based on the ITS region fromDendryphiellaandScolecobasidium

Dendry phiella中各個堿基所占比例相近,T含量略高,G+C含量為46.8%。Scolecobasidium的G+C含量為54.5%,G含量達到30.1%,遠高于Dendryphiella;T含量僅為19.6%,遠低于Dendry phiella (見表1)。

表1 Dendryphiella和Scolecobasidium堿基組成Table 1 The base composition ofDendry phiella andScolecobasidium

基于Kimura雙參數(shù)模型計算Dendry phiella和Scolecobasidium間的遺傳距離,結(jié)果表明:D.arenaria和D.salina各菌株間遺傳距離為0.000～0.013,與Dendry phiellasp.和小麥小樹狀霉D.triticicola間的遺傳距離為0.089～0.095,與D.vinosa間的遺傳距離為0.397～0.407,與Scolecobasidium各菌株間的遺傳距離為為0.491～0.620,Dendry phiella和Scolecobasidium間的平均遺傳距離為0.533。

以歧異指數(shù)檢測堿基替換同質(zhì)性,蒙特卡羅法進行顯著性檢驗,結(jié)果表明:Dendry phiella屬內(nèi)歧異指數(shù)為0.000～0.006,Scolecobasidium屬內(nèi)歧異指數(shù)為0.000～1.565,兩屬屬間歧異指數(shù)為0.362～6.822。海洋真菌D.arenaria和D.salina與Scolecobasidium屬間歧異指數(shù)為1.143～6.822,堿基替換格局差異顯著(P<0.05)。

3 討論

分生孢子大小以及隔膜數(shù)是區(qū)分2種海洋Dendryphiella真菌主要的形態(tài)分類特征[4]。D.arenaria分生孢子通常具有1～3個橫隔膜,大小為9～20×4～6μm, D.salina分生孢子隔膜數(shù)一般為2～9個,大小為14～75×6～10μm[1,6]。同時,Jones等[6]指出,隨培養(yǎng)條件的變化,該2種海洋真菌的分生孢子大小是可變的;Nicot[16]也指出在含有3.4%～20%的氯化鈉濃度的培養(yǎng)基上,D.arenaria分生孢子的隔膜數(shù)可達到5個。作者分離菌株的分生孢子,大小略大于上述描述;隔膜數(shù)最多為4個,與Nicot所描述的結(jié)果類似。Eills[12]曾將這2種真菌劃入Scolecobasidium,但并未得到Jones及Kohlmeyer等人的認(rèn)可[1,5-7],因為Scolecobasidium的產(chǎn)孢細(xì)胞屬于全壁芽生式產(chǎn)孢,并且具有齒突,而D.arenaria和D.salina的產(chǎn)孢細(xì)胞屬于內(nèi)壁芽生式產(chǎn)孢,缺少齒突。Jones等[6]通過掃描電鏡觀察,沒有發(fā)現(xiàn)D.salina的產(chǎn)孢細(xì)胞上具有類似Scolecobasidium產(chǎn)孢細(xì)胞的齒突,作者也未在對象菌株的產(chǎn)孢細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)類似Scolecobasidium的齒突。

目前,很多研究都采用遺傳距離作為物種分化的判據(jù)之一[17-18]。歧異指數(shù)可以用來鑒定那些進化上存在本質(zhì)不同的基因和譜系,是用來衡量堿基替換同質(zhì)性的1個指標(biāo)[19]。在本研究中,海洋真菌D.arenaria和D.salina與Scolecobasidium供試菌株間的遺傳距離大于Dendry phiella屬內(nèi)菌株遺傳距離,且與Scolecobasidium的堿基替換格局存在顯著差異。綜合兩屬真菌I TS的遺傳距離和堿基替換格局,認(rèn)為該2種海洋真菌無法劃入Scolecobasidium中。

Jones等[6]基于SSU+LSU序列構(gòu)建ML樹,認(rèn)為Dendry phiella的模式種D.vinosa與D.arenaria和D.salina的進化距離較遠。他們在比較ITS區(qū)序列時,未包括D.vinosa。本研究基于ITS區(qū)序列,以MP法構(gòu)建Dendry phiella和Scolecobasidium進化樹,將D.vinosa的ITS區(qū)序列包括在內(nèi)。通過比較,發(fā)現(xiàn)與Jones等的研究結(jié)果類似,D.vinosa的ITS進化距離與D.arenaria和D.salina有較大的差異,前者進化樹分支長度短于后2種。一般認(rèn)為,進化樹分支的長度與相鄰兩結(jié)點類群的進化程度有關(guān),分支越長,序列分化程度越大[20]。與D.vinosa相比,D. arenaria和D.salina的ITS區(qū)序列進化程度更高。同時,Jones等[6]還發(fā)現(xiàn)D.arenaria和D.salina與格孢腔菌屬Pleospora和匍柄霉屬Stemphylium的親緣關(guān)系較近,他們認(rèn)為這2種海洋真菌可能是一個新屬。但作者在比較Dendry phiella屬內(nèi)真菌遺傳距離時發(fā)現(xiàn),海洋真菌D.arenaria和D.salina供試菌株雖與D.vinosa的遺傳距離較大,但與Dendry phiella sp.以及D.triticicola的遺傳距離很小,無法將它們完全從Dendry phiella中分離出來。

綜合形態(tài)學(xué)特征和ITS區(qū)序列分析結(jié)果,本文將編號為OUCMBI080016的菌株鑒定為Dendry phiella arenaria,并支持D.arenaria和D.salina歸為Dendry phiella屬物種的分類地位。

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Abstract: One strain of marine fungi(No.OUCMBI080016)was isolated from the surface of young sporphytes ofL aminaria japonicaand identified asDendry phiella arenariaaccording to the morphological characteristics,which is a newly recorded species in China.To determine the taxonomic position ofD. arenariaandD.salina,the ITS sequences of seven strains in the genus ofScolecobasidiumand ten strains ofDendry phiellagenus(including seven strains from marine environment)were downloaded from Gen-Bank database for further phylogenetic analysis.Analysis of Kimura-2 parameters distance,disparity index and maximum parsimony tree(MP tree)indicated that the evolutionary lineage of marine species of Dendry phiella(D.arenariaandD.salina)is distantly related toScolecobasidium,which supported that D.arenariaandD.salinabelong toDendry phiella.

Key words: marine fungi;Dendry phiella arenaria;Scolecobasidium;ITS

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

The Primary Study on the Taxonomic Position of Dendryphiella arenaria and D.salina

SUN Kai-Ming1,TAN G Xue-Xi1,ZHANG Tian-Yu2,LI Wei1,2
(1.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Department of Plant Pathology, Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,China)

Q93

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-147-05

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家獎勵基金(BS2009NY018);青島市科技計劃基礎(chǔ)研究項目(09-1-3-13-jch);中國博士后基金(20080441151);中國科學(xué)院實驗海洋生物學(xué)重點實驗室開放基金資助

2010-04-07;

2010-06-12

孫開明(1985-),男,碩士生,主要從事海洋生態(tài)學(xué)研究。E-mail:skm-123@163.com

E-mail:liwei01@ouc.edu.cn