田 娟,施志儀

(上海海洋大學生物技術研究中心,上海201306)

甲狀腺激素受體在大菱鲆組織細胞中的表達及其與甲狀腺激素的關系

田 娟,施志儀＊＊

(上海海洋大學生物技術研究中心,上海201306)

為了探討甲狀腺激素受體在大菱鲆(Scophthalmus maximus)體內的表達情況及在細胞水平三碘甲狀腺原氨酸(T3)對甲狀腺激素受體(TR)表達量的影響,利用熒光定量PCR法檢測了大菱鲆8個組織中甲狀腺激素受體TRαA、TRβ的表達量,并設計了0,50,75,100和200 nmol/L 5個不同濃度的T3處理大菱鲆腎細胞(SMKC),采用實時熒光定量PCR法測定T3處理后甲狀腺激素受體TRαA、TRβ的表達量。結果表明,甲狀腺激素受體TRαA、TRβ在大菱鲆不同組織中的表達量各不相同,但兩者均在腎臟組織中表達量最高。在不同濃度T3處理后甲狀腺激素受體的表達量存在明顯的差異,在低濃度條件下,TRαA、TRβmRNA的表達量增加,當T3濃度達到100 nmol/L時,TRαA、TRβmRNA表達量明顯降低,說明50,75 nmol/L的T3能夠引起細胞中甲狀腺激素受體TRαA、TRβ表達量的增加,而100,200 nmol/L的T3會相對抑制細胞中甲狀腺激素受體TRαA、TRβ的表達量。

大菱鲆;三碘甲狀腺氨酸(T3);甲狀腺激素受體(TR);大菱鲆腎細胞(SMKC);實時熒光定量PCR

脊椎動物甲狀腺合成和分泌2種甲狀腺激素:三碘甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4),它們在脊椎動物的生長和代謝過程中起著重要的作用。日本學者Inui等[1]研究發(fā)現,用外源性甲狀腺素T4處理牙鲆后期仔魚,能夠促進其提前變態(tài)并提高變態(tài)成活率,用抑制甲狀腺激素合成的硫脲處理,則使牙鲆后期仔魚變態(tài)停滯。唐嘯塵等[2]在用甲狀腺素T4分別處理變態(tài)前期和變態(tài)高峰期的斜帶石斑魚仔魚時發(fā)現,高劑量與低劑量的T4對處于不同發(fā)育階段的斜帶石斑魚仔魚的影響作用各有差異。Miwa S等[3]對牙鲆變態(tài)發(fā)育過程研究發(fā)現,甲狀腺激素T3與T4生物學效應相似,并且T3相對T4具有更強的生物活性。

業(yè)已表明,甲狀腺激素產生的生物學效應都是由甲狀腺激素受體介導[4-5],甲狀腺激素通過與其受體結合,調節(jié)相關基因的表達,以發(fā)揮其生物學作用。Yamano等[6-7]克隆了牙鲆甲狀腺激素受體(TRα和TRβ)基因,其中α又包括A型和B型,這二者和β型具有一定的差別,β型又分為2種序列相近的1和2亞型,二者序列高度相似,難以區(qū)分。在牙鲆受精卵中TRαA水平比較低,孵化后TRαA水平有所提高,變態(tài)前達到高峰期的一半,在變態(tài)高峰期達到最高水平,變態(tài)后又恢復較低水平[8]。施志儀等[9]研究發(fā)現在牙鲆變態(tài)發(fā)育期間,硫脲處理組與同日齡正常組相比,甲狀腺激素受體TRαA的表達水平增高;而甲狀腺激素處理組與同日齡正常組相比,甲狀腺激素受體TRαA的表達水平降低,表明甲狀腺素對變態(tài)期牙鲆TRαA基因表達可能有下降調節(jié)作用。Dace等[10]研究發(fā)現外源激素T3能誘導哺乳動物TRα1、TRβ2受體蛋白的快速降解,但不能誘導TRα2受體蛋白的降解。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬于鰈形目(Pleuronectiformes)鲆科(Bothidae)菱鲆屬(Scophthalmus),在早期階段與牙鲆有相同的右眼移位變態(tài)發(fā)育過程,從生物進化樹中分析也與牙鲆的親緣關系比較近。本研究以大菱鲆8個不同的組織及其腎細胞為材料,從體內外研究甲狀腺激素受體的表達及其與三碘甲狀腺原氨酸(T3)的關系,為揭示鲆鰈魚類變態(tài)發(fā)育這一特殊生命現象以及激素與受體的關系提供新的資料。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗用大菱鲆成魚購于上海銅川路水產市場,在實驗室暫養(yǎng);大菱鲆腎細胞(SMKC)由中國水產科學研究院黃海水產研究所陳松林老師惠贈;DMEM培養(yǎng)基粉末、胎牛血清、Hepes、成纖維細胞生長因子(bFGF)購于Invitrogen;三碘甲狀腺原氨酸(T3)購于Sigma公司;TRIzol、RNasin Ribonuclease Inhibitor、SY BR PremixEx Taq購于TAKARA公司;M-MLV逆轉錄酶購于Promage公司;

1.2 方法

1.2.1 大菱鲆各組織總RNA的提取與cDNA的合成

用手術剪準確剪取大菱鲆腸、肌肉、脾臟、心臟、鰓、肝臟、腎臟及腦8個不同組織,生理鹽水洗凈后用TRizol試劑法提取8個組織的總RNA,分光光度計檢測其OD值,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,按Promage逆轉錄酶說明書反轉錄合成cDNA。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理 SMKC用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中含15%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL、bFGF 2 ng/mL、Hepes 20 mmol/L,置于24℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞長滿整瓶后用0.25%胰酶消化傳入六孔板中,待細胞長滿孔板更換新鮮培養(yǎng)基,同時加入甲狀腺激素T3溶液作用12 h,參照Dace等[10]對GC細胞的實驗,設計了T3的處理濃度分別為0,50,75,100和200 nmol/L,重復3次。

1.2.3 總RNA的提取與cDNA的合成 PBS溶液沖洗細胞2次后用TRIzol法提取細胞的總RNA,分光光度計檢測其OD值,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,按Promage逆轉錄酶說明書反轉錄合成cDNA。

1.2.4 引物設計 參照GenBank中大菱鲆TRαA (AF302253)、TRβ(AF302254)和β-actin(A Y008305)的相關序列,分別設計了各基因的特異性引物(見表1)。

表1 實時熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for Real-time quantitative PCR analysis

1.2.5 常規(guī)PCR擴增 PCR反應體系為:10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5μL、dNTP 2μL、10μmol/L上下游引物各0.5μL、5 U/μL的TaqDNA酶0.2μL、反轉錄產物0.5μL,補充ddH2O至25μL。反應條件為:94℃預變性3 min;94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s,共35個循環(huán);72℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產物回收純化后測序檢測。

1.2.6 實時熒光定量PCR

1.2.6.1 標準曲線的建立 樣品cDNA進行10倍系列稀釋,以稀釋后的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR,每個模板重復2次。反應體系為:SYBR Premix ExTaq(2×)10μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、cDNA模板2μL,加ddH2O至20μL。反應條件為:(1)95℃預變性1 min;(2)95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s,共40個循環(huán);(3)融解曲線制備:55～90℃,每0.5℃收集1次熒光信號,共71個循環(huán)。

1.2.6.2 目的基因的定量 對樣品cDNA進行目的基因實時熒光定量PCR擴增,反應體系及反應條件同

1.2.6.1 ,每個樣品重復3次。

1.2.6.3 數據分析 根據實時熒光定量PCR結果,以β-actin為參照基因,根據目的基因及β-actin的Ct值,按照2-ΔΔCt法計算目的基因的表達情況。運用SPSS統計軟件進行多重比較分析差異顯著性,P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大菱鲆各組織及SM KC中TRαA、TRβ的表達情況

對大菱鲆8個不同組織及SM KC進行了TRαA和TRβ的擴增,發(fā)現8個不同組織和SM KC中均檢測到TRαA、TRβ基因的表達(見圖1)。

圖1 SMKC及大菱鲆8個組織中TRαA和TRβ的表達情況Fig.1 The expression of TRαA and TRβin SMKC and eight tissues ofScophthatmus maximus

2.2 大菱鲆不同組織中甲狀腺激素受體TRαA、TRβ的表達

對大菱鲆腸、肌肉、脾臟、心臟、鰓、肝臟、腎臟及腦8個不同組織的cDNA進行熒光定量PCR擴增,根據實時熒光定量PCR結果,以β-actin為參照基因,根據目的基因及β-actin的Ct值,按照2-ΔΔCt法計算甲狀腺激素受體TRαA、TRβ在大菱鲆8個組織中的表達情況。從結果看出,甲狀腺激素受體TRαA、TRβ在大菱鲆不同組織中的表達量有明顯的差異(見圖2、圖3)。

圖2 大菱鲆不同組織中TRαA mRNA的表達量差異Fig.2 The expression of TRαA mRNA in different tissues ofScophthatmus maximus

圖3 大菱鲆不同組織中TRβmRNA表達量的差異Fig.3 The expression of TRβmRNA in different tissues ofScophthatmus maximus

從大菱鲆8個不同組織中甲狀腺激素受體TRαA、TRβ基因的表達量情況看來,腎臟組織中甲狀腺激素受體TRαA、TRβ基因的表達量均為最高,其次是肝臟組織中。以腸組織中的TRαA mRNA表達量為1個單位,腎臟中TRαA mRNA的表達量是腸組織中23.1倍,肝臟組織中的表達量是腸組織中的16.7倍,腦組織中表達量是腸組織中4倍,鰓組織中的表達量是腸組織中的2.8倍,心臟組織中的表達量是腸組織中的1.4倍,脾臟組織中表達量是腸組織中的1.1倍,肌肉組織中TRαA mRNA的表達量最少,只有腸組織中的0.7倍。以腸組織中的TRβmRNA表達量為1個單位,腎臟中TRβmRNA的表達量是腸組織中5.7倍,肝臟組織中的表達量是腸組織中的1.4倍,鰓組織中的表達量是腸組織中的1.2倍,心臟組織中的表達量是腸組織中的0.99倍,脾臟組織中表達量是腸組織中的0.7倍,肌肉組織中表達量是腸組織中0.6倍,腦組織中TRβmRNA的表達量最少,是腸組織中的0.2倍。由此看來,甲狀腺激素受體TRαA、TRβ在大菱鲆成魚組織中的表達量具有組織特異性。

2.3 T3處理對TRαA mRNA表達量的影響

根據實時熒光定量PCR結果,以β-actin為參照基因,根據目的基因及β-actin的Ct值,按照2-ΔΔCt法計算不同濃度T3處理對TRαA mRNA表達量的影響。結果表明,各濃度處理后與正常組相比變化量明顯。

結果顯示,在T3濃度0～200 nmol/L范圍內,低濃度時,與正常組比較TRαA mRNA表達量明顯上調,T3濃度為50 nmol/L時,TRαA mRNA的表達量(P=0.007<0.05)是正常組的7.9倍;T3濃度為75 nmol/L時,TRαA mRNA表達量(P=0.034<0.05)達到最大值,表達量是正常組的11.4倍;當T3濃度為100 nmol/L時,TRαA mRNA表達量(P=0.043< 0.05)降低至正常組的3.2倍;T3濃度為200 nmol/L時,TRαA mRNA表達量(P=0.013<0.05)也為正常組的3.2倍(見圖4)。

圖4 TRαA mRNA的相對表達量(不同字母間差異顯著,P<0.05)ig.4 The relative expression of TRαA mRNA(Significant difference between the different letters,P<0.05)

2.4 T3處理對TRβmRNA表達量的影響

T3處理后TRβmRNA表達量與正常組比較也有顯著差異。TRβmRNA表達量的變化趨勢與TRβ mRNA表達量的變化趨勢相同(見圖5)。當T3濃度為50 nmol/L時,TRβmRNA的表達量(P=0.003< 0.05)是正常組的5.8倍;T3濃度為75 nmol/L時, TRβmRNA的表達量(P=0.006<0.05)是正常組的6倍;而當T3濃度為100 nmol/L時,TRαA mRNA表達量(P=0.002<0.05)降至正常組的2倍;T3濃度為200 nmol/L時,TRαA mRNA表達量(P=0.012< 0.05)為正常組的1.7倍。

圖5 TRβmRNA的相對表達量(不同字母間差異顯著,P<0.05)Fig.5 The relative expression of TRβmRNA(Significant difference between the different letters,P<0.05)

3 討論

甲狀腺激素在魚類代謝活動、生殖、胚胎發(fā)育、仔魚生長、變態(tài)及其存活等方面起著重要作用[11],而甲狀腺激素產生的生物作用是通過TR介導的[1-2]。許多文獻表明甲狀腺激素誘導牙鲆變態(tài)是通過與TRs結合推動特異基因轉錄的結果[8,12-13]。甲狀腺激素進入細胞核后與受體結合,激活受體,并使之結合于基因的一段特定的DNA序列,即甲狀腺應答因子,從而正向或反向調節(jié)特定基因的轉錄和表達[14-15]。

在哺乳動物中,TR有TRα和TRβ2種亞型,其中TRα有TRα1和TRα2的2種主要的異形體,TRβ有TRβ1和TRβ2 2種異形體[16]。其中TRа1、TRβ1和TRβ2可結合T3,為功能性受體[17]。牙鲆甲狀腺激素受體基因序列與哺乳類和兩棲類動物的甲狀腺激素受體基因具有高度同源性[6-7]。Yamano通過RT-PCR和原位雜交實驗,發(fā)現TR亞型在牙鲆變態(tài)期間(TRαA、TRαB和TRβ1、TRβ2)基因表達具有組織特異性和時間特異性[18]。Madhu S.Malo等在Caco-2細胞中檢測出2種甲狀腺激素受體TRα1、TRβ1,其中TRα1基因和蛋白表達量明顯高于TRβ1占主導地位[19]。本實驗中發(fā)現,在大菱鲆腎細胞(SM KC)中表達TRαA、TRβ基因,但是未檢測到TRαB基因的表達。從大菱鲆8個組織中甲狀腺激素受體TRαA、TRβ的表達量差異來看,TRαA、TRβ在大菱鲆成魚組織中的表達量具有組織特異性。

為了進一步研究甲狀腺素與其受體之間的關系,取組織中表達量最高的腎細胞(SM KC)進行體外培養(yǎng),用不同濃度的三碘甲狀腺原氨酸(T3)處理,觀察受體表達情況。研究表明,T3對甲狀腺激素受體存在一定的調控作用。在50 nmol/L的T3處理后,受體表達量較未處理組的表達量增加;當T3濃度達到75 nmol/L時,受體的表達量達到最高;但當T3濃度達到100 nmol/L時,受體的表達量又相應的降低,這表明,低濃度的T3能夠引起受體表達量的增加,而高濃度的T3會相對抑制受體的表達。T3對TRβmRNA的表達量也有相似的調控,但兩者又有所差別,在T3濃度為50 nmol/L時,TRαA mRNA的表達量是正常組的7.9倍,TRβmRNA的表達量是正常組的5.8倍;T3濃度為75 nmol/L時,TRαA mRNA、TRβmRNA表達量達到最大值,TRαA mRNA表達量是正常組的11.4倍,TRβmRNA的表達量是正常組的6倍。這說明外源性甲狀腺激素T3對TRαA mRNA表達的影響作用較對TRβmRNA的影響作用強。

在高濃度的T3作用下,腎細胞中的甲狀腺激素受體TRαA、TRβ的表達量相對降低,這一結果與施志儀等在牙鲆仔魚體內試驗的的結果相似,在用高濃度甲狀腺素T4處理牙鲆仔魚后與正常組比較,發(fā)現處理組的TRαA mRNA的表達降低[9]。關于這一現象, Dace[10]曾有過實驗的說明,他們通過細胞轉染和Western blotting研究發(fā)現外源激素T3能誘導哺乳動物TRα1、TRβ2受體蛋白的快速降解,但不能誘導TRα2受體蛋白的降解。研究表明蛋白酶介導的降解對于甲狀腺激素受體的轉錄活性起著關鍵作用。在哺乳動物中,甲狀腺激素T3結合到甲狀腺激素受體上,能誘導甲狀腺激素受體降解,此降解過程經蛋白酶體路線進行,同時可受到泛素蛋白-蛋白酶體降解路線中的1種選擇性抑制劑Lactacystin的抑制,在蛋白酶體抑制劑存在的情況下,甲狀腺素β1受體水平升高,而T3依賴的轉錄活性和基因表達會受到抑制。這表明蛋白酶體調控的甲狀腺激素受體降解對甲狀腺激素受體的轉錄激活作用著重要的調控功能。由此推測甲狀腺激素的作用機制可能是T3與受體結合,導致了激素-結合受體構型的改變,易于蛋白酶體的降解,生成可與共激活因子結合的活性區(qū)(可能是AF-2)從而激活靶基因的轉錄。在鲆鰈魚類中的甲狀腺激素受體的降低也可能與這種機制有關,但還需要更多研究加以證實。

綜上所述,甲狀腺激素受體在大菱鲆成魚8個組織中均有表達,但其表達量卻有明顯的差異,具有組織特異性。在腎細胞中的研究表明三碘甲狀腺原氨酸(T3)對甲狀腺激素受體TRαA和TRβ都有一定的調控作用,低濃度的T3增加受體的表達量,而高濃度的T3會相對抑制受體的表達,其調控的分子機制有待進一步的研究。

致謝:在本研究中,中國水產科學研究院黃海水產研究所陳松林研究員在細胞培養(yǎng)中給予了幫助,特此感謝!

[1] Inui Y,Miwa S.Thyroid hormone induces metamorphosis of flounder larvae[J].Gen Comp Endocrinol,1985,60:450-454.

[2] 唐嘯塵,劉曉春,林浩然,等.甲狀腺素對斜帶石斑魚仔魚變態(tài)的影響[J].熱帶海洋學報.2006,1(1):33-37.

[3] Miwa S,Inui Y.Effects of various doses of thyroxine and triiodothyronine on the metamorphosis of flounder(Paralichthys olivaceus)[J]. Gen Comp Endocrinol,1987,67(3):356-63.

[4] Escriva H,Robinson M,Lauder V.Evolutionary biology of the nuclear receptor superfamily.In Nuclear Receptors[M].A Practical Approach,Oxford:Oxford University Press,1999,1-28.

[5] 張俊玲,施志儀.牙鲆早期階段的變態(tài)發(fā)育及其機制[J].上海水產大學學報,2003,12(4):348-352.

[6] Yamano K,Araki K,Sekikawa K,et al.Cloning of thyroid hormone receptor genes expressed in metamorphosis flounder[J].Developmental Genetics,1994a,15:378-392.

[7] Yamane K,Inui Y.cDNA cloning of thyroid hormone receptorβfor the Japanese flounder[J].Developmental Genetics,1995,199:197-203.

[8] Yamano K,Miwa S.Differential gene expression of thyroid hormone recepterαandβin fish development[J].Gen Comp Endocrinol,1998,109:75-85.

[9] 施志儀,劉華.甲狀腺激素受體TRαA基因在牙鲆不同變態(tài)發(fā)育階段中的表達差異[J].上海水產大學學報.2005,12(4):359-363.

[10] Dace A,Zhao L,Park K S,et al.Hormone binding induces rapid proteasome-mediated degradation of thyroid hormone receptors [J].PNAS,2000,97:8985-8990.

[11] 張臻宇,鮑寶龍.魚類早期發(fā)育階段甲狀腺激素的作用[J].上海水產大學學報,1999,8(1):68-75.

[12] Inui Y,Yamano K,Miwa S.The role of thyroid hoemone in tissue development in metamorphosing flounder[J].Aquaculture, 1995,135:87-98.

[13] Power D M,Llewellyn L,Faustino M,et al.Thyroid hormones in growth and development of fish[J].Com Biochem Physiol, Part C,2001,130:447-459.

[14] Glass Christopher K,Rodrigo Franco,Cary Weinberger,et al.A cerb-A binding site in rat growth hormone gene mediates trans-activation by thyroid hormone[J].Nature,1987,329:738-741.

[15] Chatterjee V K,J K Lee,A Rentoumis,et al.Negative regulation of the thyroid-stimulating hormone alpha gene by thyroid hormone:receptor interaction adjacent to the TATA box[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:9114-9118.

[16] 馮綺文,蘇青.甲狀腺激素受體研究進展[J].第二軍醫(yī)大學, 2003,23:1003-5435.

[17] Abel E D,Boers M E,Pazos-Moura C,et al.Divergent roles for thyroid hormone receptor beta isoforms in the endocrine axis and auditory system[J].J Clin Invest,1999,104:291-300.

[18] Yamano K,Miwa S.Differential gene expression of thyroid hormone recepterαandβin fish development[J].Gen Comp Endocrinol,1998,109:75-85.

[19] Malo M S,Zhang W,Alkhoury F,et al.Thyroid hormone positively regulates the enterocyte differentiation marker intestinal Alkaline Phosphatase gene via an atypical response element[J]. Molecular Endocrinology,2004,18(8):1941-1962.

Abstract: In order to study the expression of thyroid hormone receptor(TR)gene inScophthatmus maximusand the effects of triiodothyronine(T3)on the expression of thyroid hormone receptor(TR) gene at the cellular level,Real-time fluorescent quantitative PCR was applied to detect the expression of TRαA mRNA and TRβmRNA in eight different tissues ofScophthatmus maximusand the SM KC that was treated by T3 in five different concentrations(0,50,75,100 and 200 nmol/L).The results showed that the expression of TRαA mRNA and TRβmRNA were various in the different tissues ofScophthatmus maximus.Both TRαA mRNA and TRβmRNA showed their highest expression in the kidney tissue. There was a significant difference on the expression of thyroid hormone receptor(TR)after treated by T3 using different concentrations.The expression of TRαA and TRβmRNA were increased in low concentration.However,the TRαA and TRβmRNA expression decreased significantly when the concentration of T3 up to 100nM.It was shown that 50nM and 75nM of T3 can increase the TRαA and TRβmRNA expression,while 100nM and 200nM of T3 can inhibit their expression relatively.

Key words: Scophthalmus maximus;triiodothyronine(T3);thyroid hormone receptor(TR);SMKC; real-time fluorescence quantitative PCR

責任編輯 于 衛(wèi)

The Expression of Thyroid Hormone Receptor in the Tissues and Cells of Scophthatmus maximus and Relationship Between It and Thyroid Hormone

TIAN Juan,SHI Zhi-Yi
(Biotechnology Research Center,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

S917;Q291

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-105-05

國家自然科學基金項目(30571420);國家教育部博士項目基金(20040264001);上海市重點學科水生生物學建設項目(S3070)資助

2010-04-12;

2010-06-12

田 娟(1984-),女,碩士生,研究方向:魚類發(fā)育生物學。E-mail:tian_hjuan@163.com

Tel:021-61900051;E-mail:zyshi@shou.edu.cn