張晨晨,王昭萍,于瑞海,邸煒鵬,孔 靜,劉 劍

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

低滲誘導櫛孔扇貝三倍體及與其它方法的比較

張晨晨,王昭萍＊＊,于瑞海,邸煒鵬,孔 靜,劉 劍

(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室,山東青島266003)

采用低滲抑制受精卵第2極體(PB2)的釋放誘導櫛孔扇貝(Chlamys f arreri)三倍體。水溫20℃時,分別進行不同鹽度處理(8～20)、不同起始處理時間(受精后15～40 min)和不同持續(xù)處理時間(10～25 min)的實驗,對三倍體處理組和對照組幼蟲的生長進行觀察,同時將低滲、6-DMAP、熱休克、冷休克4種誘導方法進行對比。結(jié)果表明:受精后30 min開始處理20 min,誘導率最高,可達(92.36±2.41)%,卵裂率為(49.78±6.51)%,孵化率為(61.82±1.63)%;D形幼蟲期,處理組幼蟲表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢(P<0.01),不僅生長速度快,而且發(fā)育到變態(tài)時個體比二倍體大;低滲誘導的三倍體率與6-DMAP相比無顯著差異(P>0.05);與熱休克和冷休克相比差異顯著(P<0.01)。

櫛孔扇貝;三倍體;低滲誘導

櫛孔扇貝(Chlamys f arreri)味道鮮美,營養(yǎng)豐富,是我國北方扇貝養(yǎng)殖的主要種類,占扇貝養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%以上。已有的研究結(jié)果證實,三倍體櫛孔扇貝與二倍體相比,具有明顯的生長優(yōu)勢[1],閉殼肌和軟體部的重量均大于二倍體[2-3],開發(fā)利用三倍體的生物學優(yōu)勢對提高我國扇貝養(yǎng)殖業(yè)的技術水平和經(jīng)濟效益具有重要意義。

自1990年代初以來,我國研究者先后用溫度休克[4]、細胞松馳素B(簡稱CB)[5]、6-二甲基氨基嘌呤(簡稱6-DMAP)[6]等方法進行了櫛孔扇貝三倍體的誘導研究。各種方法均能誘導產(chǎn)生三倍體但又各具其缺點。其中CB和6-DMAP誘導效果較好但誘導劑的毒副作用大大降低了幼蟲的孵化率[5-6],操作繁瑣,且誘導劑的安全性也有待進一步驗證;溫度休克雖然無毒,但其誘導率較低[4];四倍體與二倍體雜交的生物方法安全穩(wěn)定,理論上三倍體率可高達100%,但目前通過抑制第一極體,僅得到5個櫛孔扇貝四倍體稚貝[7],且未能保存下來,四倍體的培育仍是一道待攻克的難關。

低滲處理是1種誘導多倍體的新方法,在蝦夷扇貝三倍體誘導中取得了較好效果[8]。本文報道了采用低滲方法誘導櫛孔扇貝三倍體的結(jié)果,以及三倍體與二倍體的生長情況,并與其他誘導方法進行對比。

1 材料與方法

1.1 親貝暫養(yǎng)、產(chǎn)卵、受精

實驗用親貝取自青島仰口海區(qū),殼長6～7 cm。雌、雄貝分開暫養(yǎng)于16℃的水體中,室內(nèi)促熟培育。實驗時挑選性腺充分成熟的雌、雄親貝,陰干1 h后,分別放入2個水槽中,加入新鮮升溫過濾海水,誘導排放。分別收集卵液和精液,人工受精。

1.2 低滲誘導

在40%～50%受精卵出現(xiàn)第一極體(PB1)時進行低滲處理,抑制PB2釋放以獲得三倍體。低滲鹽度梯度為8,10,12,14,16,18,20,持續(xù)處理15 min。孵化后收集幼蟲進行倍性分析,以確定最適低滲鹽度。

采用最適低滲鹽度,分別在受精后15,20,25,30, 35,40和45 min開始處理,持續(xù)處理15 min后放回正常海水孵化,根據(jù)幼蟲倍性分析結(jié)果,確定最佳處理時機。

在上述實驗基礎上,采用得出的最佳處理鹽度和最佳處理時機,分別對受精卵低滲處理10,15,20和25 min,根據(jù)幼蟲倍性分析結(jié)果,確定最佳處理持續(xù)時間。

以上實驗均重復3次以上,產(chǎn)卵及孵化水溫均保持在20℃。

1.3 幼蟲培育

采用最適誘導條件(低滲鹽度、處理時機和處理持續(xù)時間)誘導櫛孔扇貝的受精卵,以未處理的受精卵作為對照組,池內(nèi)孵化,觀察胚胎發(fā)育及卵裂情況;D形幼蟲時用300目篩絹選幼,放入新池中培育,檢測孵化率和誘導率。每日投餌、換水、觀察幼蟲生長及攝食情況,每2 d測量實驗組與對照組幼蟲的殼長,每次測量20個幼蟲,從選幼開始到變態(tài)附著結(jié)束。

1.4 不同三倍體誘導方法比較

水溫20℃,催產(chǎn)同一批扇貝的精卵,采用低滲、6-DMAP、熱休克和冷休克4種方法誘導三倍體,比較其誘導效果。低滲處理采用本研究確定的最佳方按,其他方法采用文獻報道的最佳處理方案:①低滲:本研究確定最佳鹽處理條件;②6-DMAP:濃度60 mg/L,處理時間15 min[6];③熱休克:30℃,處理時間15 min;④冷休克:1℃,處理時間20 min[4]。設對照組,統(tǒng)計受精率、孵化率和三倍體率。

1.5 幼蟲倍性檢測方法及相關參數(shù)

收集D形幼蟲,加入DAPI熒光染液,采用Partec PAⅡ流式細胞儀(FCM)進行倍性檢測。

卵裂率為分裂卵數(shù)占總處理卵數(shù)的百分比。孵化率為D型幼蟲數(shù)占受精卵數(shù)的百分比。三倍體誘導率為三倍體分裂相占分裂相總數(shù)的百分比,由FlowMax Software軟件計算得出。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示,所有統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件進行。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀倍性檢測結(jié)果

圖1為對照組與最佳處理組的流式細胞儀倍性檢測圖,三倍體率高達94.93%。

圖1 流式細胞儀倍性檢測結(jié)果Fig.1 Ploidy level revealed by flow cytometry

2.2 不同低滲鹽度的誘導效果

水溫20℃條件下,40%～50%受精卵出現(xiàn)PB1時,用鹽度為8～20的低滲海水處理15 min,結(jié)果見圖2。鹽度8～20的低滲海水均能誘導櫛孔扇貝產(chǎn)生三倍體,當鹽度達到14時,三倍體誘導率最高,為(87.76 ±2.77)%;鹽度繼續(xù)升高,三倍體誘導率呈現(xiàn)下降趨勢,由此可以確定最佳低滲誘導鹽度為14。

低滲鹽度的變化對受精卵的發(fā)育和孵化影響較大,卵裂率和孵化率隨著鹽度的升高而持續(xù)升高,在最適鹽度14時,卵裂率和孵化率分別為(50.92± 5.83)%、(63.22±5.06)%,比對照組(80.90± 4.53)%、(86.65±6.52)%低。2.3處理時機對誘導效果的影響

圖2 不同低滲鹽度處理對受精卵孵化、卵裂及獲得三倍體的影響Fig.2 Results of hatchery,cleavage,triploidy with hypotonic treatment at different salinity

圖3 不同起始處理時間對受精卵孵化、卵裂及獲得三倍體的影響Fig.3 Results of hatchery,cleavage,triploidy with hypotonic treatment at different initial treating time

以最佳低滲鹽度S=14,在受精后15～40 min處理受精卵15 min,結(jié)果見圖3。起始處理時間不同,誘導率不同,其中以受精后30 min開始處理,誘導率最高,達(88.07±3.25)%;卵裂率和孵化率在受精后15 min開始處理時最低,隨著起始處理時間的推遲而增加。由此可確定最佳處理時機為受精后30 min。

圖4 不同持續(xù)處理時間對受精卵孵化、卵裂及獲得三倍體的影響Fig.4 Results of hatchery,cleavage,triploidy with hypotonic treatment under different duration of treatment

2.5 幼蟲生長

在20℃水溫條件下,采用最佳誘導條件,受精后30 min,以低滲鹽度S=14處理受精卵20 min,誘導櫛孔扇貝三倍體,并進行幼蟲培育。圖5為三倍體處理組(3n)與二倍體對照組(2n)的生長曲線。誘導群體D形幼蟲的三倍體率為90.15%,卵裂率為45.74%,孵化率為60.47%;二倍體對照組的卵裂率為71.23%,孵化率為80.77%。處理組胚胎發(fā)育速度較對照組慢,至D形幼蟲時相差4～5 h;誘導組的初孵D形幼蟲殼長((113.5±4.6)μm)也比對照組((116.8±3.7)μm)略小,但生長較快,至第4天,3n的殼長逐漸超過2n;第2天～第6天,3n與2n的生長速度差異不顯著P> 0.05,第8天到附著變態(tài),2組生長差異顯著P<0.01,處理組幼蟲表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢。3n從受精到附著變態(tài)為稚貝共13 d,2n對照組為15 d。

2.6 4種方法的誘導效果比較

水溫20℃,催產(chǎn)獲得同一批精卵,同時受精,分別采用低滲處理、6-DMAP、熱休克和冷休克誘導處理,三倍體誘導率以低滲處理組最高為(91.43±4.14)%, 6-DMAP處理組次之為(91.25±3.49)%;熱休克和冷休克誘導率較低,分別為(25.85±4.94)%和(21.86± 2.04)%(見圖6),低滲與6-DMAP處理組的卵裂率、孵化率及誘導率明顯高于熱休克和冷休克組,差異顯著,P<0.01;低滲的誘導效果與6-DMAP相比無顯著差異,P>0.05。

2.4 不同持續(xù)處理時間對誘導效果的影響

在精卵受精后30 min,以最佳低滲鹽度S=14處理受精卵10～25 min,結(jié)果見圖4。卵裂率和孵化率隨著持續(xù)處理時間的延長而降低,三倍體誘導率以持續(xù)處理20 min組最高,為(92.36±2.41)%,由此可確定最佳持續(xù)處理時間為20 min。

圖5 三倍體處理組和對照組幼蟲的生長比較Fig.5 Difference of larval growth between treated group and control

圖6 不同三倍體誘導方法對受精卵孵化、卵裂及獲得三倍體的影響Fig.6 Results of hatchery,cleavage,triploidy with different triploid induction methods

3 討論

從1981年Stanley利用細胞松弛素B誘導美洲牡蠣(Crassostrea virginica)獲得三倍體以來,三倍體貝類就以其不育性、生長快、品質(zhì)好等優(yōu)點而成為貝類細胞遺傳育種研究的熱點。迄今為止,已在牡蠣、扇貝、鮑等30余種貝類中進行了多倍體的育種研究[3]。已有的研究表明,三倍體扇貝可以產(chǎn)生較大的閉殼肌[1],從而使得三倍體的優(yōu)勢在扇貝中表現(xiàn)更為突出,也因此扇貝三倍體的研究更受重視。

3.1 低滲方法誘導扇貝多倍體的優(yōu)勢

國內(nèi)外學者對扇貝的多倍體育種做了大量的研究,誘導方法多種多樣,包括CB[5]、6-DMAP[6]等化學誘導、冷休克、熱休克[4]及低滲處理[8]等物理方法。各種方法均能誘導產(chǎn)生三倍體。已有的報道中,櫛孔扇貝三倍體誘導以6-DMAP的誘導效果最好,三倍體率最高為88.4%[6],但6-DMAP價格昂貴,操作繁瑣,其安全性也有待于進一步驗證;CB是1種劇毒化學藥物,有強致癌性,且價格昂貴,已報道的櫛孔扇貝三倍體誘導率最高為50%[5];冷休克和熱休克雖然無毒,但誘導效果較差,已報道的研究中最高誘導率分別為30.4%和27.6%[4]。低滲處理安全無毒,且操作簡單,迄今只用于蝦夷扇貝三倍體誘導,在櫛孔扇貝和其他貝類中尚未見報道。

本研究探索了低滲誘導櫛孔扇貝三倍體的最佳誘導參數(shù),在受精后30 min開始,以低滲鹽度14處理受精卵20 min,三倍體誘導率可高達(92.36±2.41)%,超過已報道的所有方法的誘導效果。

本研究采用同一批受精卵用不同方法處理,比較其誘導效果,以減少系統(tǒng)誤差。結(jié)果顯示,低滲和6-DMAP處理的誘導效果較好,三倍體誘導率分別為(91.43±4.14)%和(91.25±3.49)%,明顯高于熱休克和冷休克的誘導效果;低滲和6-DMAP的誘導效果無明顯差異,但低滲處理組的孵化率為(63.22± 5.06)%,高于6-DMAP誘導組(57.23±5.64)%。從操作過程來看,低滲處理操作簡單,處理結(jié)束后可以直接移入較大體積的海水中培育,不需像6-DMAP處理那樣要洗卵去除藥液;從成本來看,低滲處理成本幾乎為零,而6-DMAP價格昂貴;從安全性來看,低滲處理安全無毒,而6-DMAP具有一定的毒副作用,其安全性尚有待于進一步驗證。綜合來看,低滲方法具有誘導率高、安全無毒、操作簡便、成本低等優(yōu)點,適于生產(chǎn)應用,具有廣闊的應用前景。

3.2 影響低滲誘導效果的主要因素

影響貝類多倍體誘導的因素很多,除了誘導方法上的差異外,處理時機和處理強度是影響誘導率高低的關鍵性因素,尤其是處理時機的把握是多倍體誘導成功與否的決定性因素。只有合適的時機施加適當?shù)奶幚聿拍芤种茦O體的釋放,從而獲得多倍體,過早或過晚處理都將錯過抑制減數(shù)分裂的最佳時機,無法達到染色體加倍的目的。一般認為當40%～50%受精卵出現(xiàn)第一極體是較為適宜的處理時機[2]。櫛孔扇貝胚胎發(fā)育最佳溫度為18.0～22.0℃,鹽度為30.0～32.5;幼蟲培育最佳溫度為19.0～22.0℃,鹽度為27.0～32.0[12]。通過預實驗,養(yǎng)殖海區(qū)的鹽度為31,櫛孔扇貝在20℃時受精,第一極體出現(xiàn)的時間為受精后15 min,受精后25～30 min第一極體排出40%～50%,第二極體出現(xiàn)。從實驗的結(jié)果來看,受精后30 min開始處理是最佳誘導時機,誘導率最高,與按照極體出現(xiàn)的百分率時間相符,開始處理時間過早或過晚,其誘導效果都較差。

處理強度(處理的劑量和處理持續(xù)時間)對多倍體的誘導效果影響也很大,一般誘導率隨誘導強度的增大而升高,但處理強度的加大會導致胚胎的畸形發(fā)育,影響孵化率和成活率,從而造成誘導率降低的現(xiàn)象[8]。本研究中低滲誘導櫛孔扇貝三倍體的最佳誘導強度為:低滲鹽度S=14,持續(xù)處理時間20 min。

多倍體誘導率的高低很大程度上還受胚胎發(fā)育同步性的影響,只有受精卵同步發(fā)育,經(jīng)過適宜的誘導處理才能獲得較高的誘導率。受精卵發(fā)育同步與否,與卵子是否同步受精有關,也與卵子的質(zhì)量有關。充分成熟的親貝產(chǎn)出的卵子發(fā)育的同步性較高[6]。對櫛孔扇貝而言,盡量延長親貝暫養(yǎng)時間,避免人為刺激提早產(chǎn)卵,是目前研究條件下獲得充分成熟卵子的有效方法。另外,受精卵發(fā)育的同步性與操作過程中的方法有關,雌雄貝應分開暫養(yǎng),在處理過程中雌雄親貝嚴格隔離,以避免精子污染,采用人工授精,以保證卵子同步受精。

3.3 三倍體扇貝的生長優(yōu)勢

三倍體貝類的生長優(yōu)勢已在幾乎所有研究的貝類中得以證實。從細胞遺傳學角度來看,三倍體是非偶數(shù)染色體組,故阻礙了生殖細胞正常的減數(shù)分裂,結(jié)果常常導致性腺發(fā)育的衰退或非整倍體配子的產(chǎn)生。三倍體最明顯的優(yōu)勢在于其具有不育性,使其只有極少能量用于性腺發(fā)育,更多的能量用于生長。人工誘導的三倍體貝類在正常二倍體性腺未成熟前與二倍體大致相同,但在二倍體繁殖期間,三倍體的生長也不停滯,產(chǎn)卵期之后的生長明顯優(yōu)于二倍體[13-14]。三倍體貝類的生長優(yōu)勢不僅表現(xiàn)在性腺發(fā)育階段,從幼蟲階段開始生長速度就較快,這可能與多倍體的巨態(tài)發(fā)育有關。貝類的發(fā)育屬于“嵌合型”,即發(fā)育分化主要取決于形態(tài)發(fā)生因子的分離,發(fā)育的進程由分裂的次數(shù)決定,缺乏補償機制,細胞體積增大而細胞數(shù)目并不減少,結(jié)果導致三倍體個體的增大[15]。本實驗的結(jié)果支持了這一假說,三倍體誘導組幼蟲的生長速度明顯快于二倍體對照組,且比對照組早兩天附著變態(tài),充分顯示出了三倍體的生長優(yōu)勢。

3.4 低滲誘導方法的應用前景

本研究探索了低滲誘導櫛孔扇貝三倍體的最佳參數(shù),誘導率達91.43%±4.14%,在已有報道的結(jié)果中最高,具有安全無毒、操作簡便、成本低、誘導率高等優(yōu)于其他多倍體誘導方法的優(yōu)勢,是一種新型的安全、高效、環(huán)保、簡便的多倍體誘導方法,適合于生產(chǎn)應用,并能適用于其它海洋生物的多倍體誘導,具有廣闊的應用前景。低滲誘導三倍體的作用機理目前尚不明確,可能與低滲引起的能量代謝紊亂影響微管和微絲的形成有關,還有待于進一步的研究。

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Abstract: Hypotonic treatment was used in triploid induction inChlamys f arreriby inhibiting polar bodyⅡ(PB2)releasing.Different hypotonic treatments,including salinity(8～20),initial treating time (15～40 min after fertilization),and duration time(10～25 min),were tested at 20℃water temperature. Triploid group and diploid group were designed to imestigate the growth of larva.Four different triploid induction methods were compared including hypotonicity,6-DMAP,cold shock and heat shock.The Results indicated that the optimal hypotonic treatment was 30 min after fertilization,which can resulted in the highest triploidy rate which was up to(92.36±2.41)%,(49.78±6.51)%cleavage rate and(61.82 ±1.63)%hatchery rate.The triploid group showed obvious growing advantage in the larvae stage(P< 0.01),the growing speed of triploid larvae was rapid,and the shell length was longer than diploid larvae when it growed to metamorphosis.Comparison of triploidy rate showed no significant difference between the treatment of hypotonicity and 6-DMAP,while there was significant difference between the treatment of hypotonicity and temperature shock.

Key words: Chlamys f arreri;triploid;hypotonic treatment

責任編輯 于 衛(wèi)

Triploid Induction in Chlamys farreri by Hypotonic Treatment and The Comparison with Other Treatment Methods

ZHANG Chen-Chen,WANG Zhao-Ping,YU Rui-Hai,DI Wei-Peng,KONGJing,LIU Jian
(The Key Llaboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

S963.8

A

1672-5174(2010)09Ⅱ-071-05

國家自然科學基金項目(30771622);國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2006AA10A401)資助

2010-01-12;

2010-03-29

張晨晨(1985-),女,碩士生,主要從事貝類養(yǎng)殖研究。E-mail:zhangchenchen1985@163.com

Tel:0532-82031623;E-mail:zpwang@ouc.edu.cn