韓寧寧，肖冬光，張翠英，胡亞麗，林康

（工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

木糖發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇條件的優(yōu)化

韓寧寧，肖冬光*，張翠英，胡亞麗，林康

（工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

利用一株肺炎克雷伯氏菌發(fā)酵木糖生產(chǎn)2,3-丁二醇，運用單因素試驗和四因素三水平L9（34）正交試驗設(shè)計的方法，探討發(fā)酵pH、溫度、裝液量和轉(zhuǎn)速對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：在木糖濃度80 g/L、接種量6%（體積分?jǐn)?shù)）、初始pH值6.0、轉(zhuǎn)速120 r/min、裝液量80 mL/250 mL、35℃的條件下發(fā)酵84 h，木糖利用率為90%，2,3-丁二醇的質(zhì)量濃度為33.0 g/L，得率為0.46 g/g，達(dá)到理論值的92%。

肺炎克雷伯氏菌；2,3-丁二醇；木糖；發(fā)酵

Abstract:The production of 2,3-butanediol was carried out from fermentation of xylose by Klebsiella pneumoniae.The effects of pH，temperature,amount of medium and rotation on 2,3-butanediol were studied by the single-factor tests and L9（34）orthogonal design experiment.The parameters of optimum fermentation were suggested as follows：xylose mass concentration 80 g/L,inoculum 6%（volume fraction），initial pH value 6.0，rotation120 r/min，amount of medium 80 mL/250 mL and 35℃，concentration of 2,3-butanediol reached 33.0 g/L and yield of 2,3-butanediol from xylose was 0.46 g/g.

Key words：Klebsiella pneumoniae；2,3-butanediol；xylose；fermentation

2，3-丁二醇（2，3-Butanediol，2，3-BD）是一種重要的化工原料和液體燃料，廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品及航空航天等領(lǐng)域[1-4]。工業(yè)上生產(chǎn)2，3-丁二醇的主要方法是化學(xué)法，其生產(chǎn)2，3－丁二醇主要是以石油裂解時產(chǎn)生的四碳類碳?xì)浠衔镌诟邷馗邏合滤獾玫?，然而隨著石油危機的日趨加劇，尋找新的可替代能源成為迫切需要解決的問題[5-6]。微生物可以利用糧食或木質(zhì)纖維素為底物生產(chǎn)2，3－丁二醇，其中利用葡萄糖為底物生產(chǎn)2，3－丁二醇研究較多。但由于糧食危機的存在，利用豐富而且廉價的可再生資源木質(zhì)纖維類物質(zhì)為原料發(fā)酵生產(chǎn)2，3－丁二醇成為必然趨勢。木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖,由半纖維素水解生成,含量可達(dá)植物纖維水解糖類的35%以上[7]。目前文獻(xiàn)報道中多研究利用由木質(zhì)纖維素降解的葡萄糖，木質(zhì)纖維素的利用率僅為30%左右[8]，以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的研究將會提高木質(zhì)纖維類原料的利用率，可使木質(zhì)纖維素的利用率達(dá)50%以上，在開發(fā)新能源和環(huán)境保護(hù)等方面具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益[9-10]。本文研究了各種發(fā)酵條件對肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae 10011發(fā)酵木糖生產(chǎn)2,3-丁二醇的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種

肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae，CICC，10011）：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖20；蛋白胨10；酵母粉5；氯化鈉10；瓊脂20。

1.2.2 種子培養(yǎng)基（g/L）

木糖20；蛋白胨10；酵母粉 5；氯化鈉10；pH 7.0。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

木糖 80；酵母粉 15.0；KH2PO410.0；K2HPO410.0；（NH4）2SO42.0；檸檬酸鈉 4.0；MgSO4·7H2O 0.4；CaCl20.05；FeSO4·7H2O 0.005；ZnSO4·7H2O 0.005；EDTA 0.05；pH 6.0。

1.2.4 試劑

2,3-丁二醇（Sigma，色譜純），異戊醇（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純），D-木糖（博大泰克，分析純），試驗過程中使用的其他化學(xué)試劑均為分析純以上級別。

1.2.5 主要儀器

7890A型氣相色譜儀：美國安捷倫科技公司；722型分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：取一環(huán)斜面種子接入裝有一定量液體培養(yǎng)基的250 mL三角中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)24 h。按6%的接種量轉(zhuǎn)接一級種子到250 mL三角瓶中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)18 h。

初始發(fā)酵培養(yǎng)條件：按5%的接種量轉(zhuǎn)二級種子培養(yǎng)基到發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL，初始pH為6.0，置于37℃搖床上發(fā)酵，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min。其中初始pH值、溫度、裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速、木糖濃度各單因素在優(yōu)化過程中會進(jìn)行相應(yīng)的變化。

1.4 分析方法

1.4.1 木糖濃度的測定

采用地衣酚法[11]。發(fā)酵液于4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取上清液適當(dāng)稀釋，使稀釋液中木糖濃度控制在 0 μg/mL~33 μg/mL 范圍內(nèi)。

1.4.2 2,3-丁二醇濃度的測定

用乙酸乙酯與發(fā)酵液離心上清液以體積比1∶1進(jìn)行萃取，待靜置分層后取上層液進(jìn)行氣相分析。

氣相色譜具體測定條件如下：色譜柱：Aglient HPINNOWax 1909IN-213；柱長：30 m；內(nèi)徑：0.320 mm；檢測器：FID（250℃）；柱溫：180℃；進(jìn)樣溫度：230℃；載氣壓力：氮氣（1.8 mL/min）；氫氣（30 mL/min）；空氣（300 mL/min）；內(nèi)標(biāo)物：異戊醇。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響

pH在調(diào)節(jié)細(xì)菌的代謝過程中起著重要的作用，尤其是在含有大量復(fù)合產(chǎn)物的發(fā)酵過程中，pH對發(fā)酵結(jié)果的影響尤為明顯。本試驗將發(fā)酵液初始pH值調(diào)至不同水平，考察了初始pH值對丁二醇產(chǎn)量的影響，試驗結(jié)果見表1。

表1 初始pH值對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of initial pH to 2,3-butanediol

從表1可以看出，當(dāng)pH值為6.0時木糖的利用率及2,3-丁二醇的得率均達(dá)到最大值，當(dāng)pH值低于或高于6.0時木糖利用率及2,3-丁二醇質(zhì)量濃度均有明顯下降，可見pH值對該發(fā)酵過程影響較為顯著，其適宜的pH值為6.0。

2.2 溫度對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響

通常細(xì)菌發(fā)酵的最適溫度范圍是30℃～37℃[12]，本試驗檢測了這個范圍內(nèi)的溫度變化對發(fā)酵木糖產(chǎn)2,3-丁二醇的影響，試驗結(jié)果見表2。

表2 溫度對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of temperature to 2,3-butanediol

表2結(jié)果顯示，在30℃~37℃之間，木糖利用率和2,3-丁二醇的得率均隨著溫度呈先升高后降低的趨勢，在35℃時木糖利用率及2,3-丁二醇的得率達(dá)到最高。

2.3 裝液量對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響

通氣量對于2,3-丁二醇發(fā)酵具有重要的影響，搖床轉(zhuǎn)速固定在100 r/min，調(diào)節(jié)不同裝液量進(jìn)行發(fā)酵，考察裝液量對丁二醇產(chǎn)量的影響，試驗結(jié)果見表3。

由表3可知：裝液量太大，溶氧效果差，2,3-丁二醇的產(chǎn)量低；裝液量太小，溶氧過大，也降低了2,3-丁二醇的產(chǎn)量，結(jié)果表明l00 mL/250 mL裝液量最好。

2.4 接種量對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響

接種量通常也是影響發(fā)酵的一個重要因素，本試驗考察了不同接種量對發(fā)酵木糖產(chǎn)2,3-丁二醇的影響，試驗結(jié)果見表4。

表3 裝液量對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響Table 3 Effects of amount of medium to 2,3-butanediol

表4 接種量對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of inoculum to 2,3-butanediol

由表4可知，接種量為6%時發(fā)酵木糖產(chǎn)生的2,3-丁二醇量最高。接種量小時，木糖利用率低，產(chǎn)生的2,3-丁二醇的量也低；接種量過大時，發(fā)酵液中2,3-丁二醇的量降低，可能的原因是接種量過大時，底物中糖含量不足以滿足菌種生長需要，營養(yǎng)物過早耗竭，導(dǎo)致菌體過早自溶影響2,3-丁二醇產(chǎn)量。

2.5 轉(zhuǎn)速對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響

2,3-丁二醇是典型的微好氧代謝產(chǎn)物，2,3-丁二醇的形成與溶氧有密切的關(guān)系，隨著溶解氧的升高，2,3-丁二醇的形成量增高，但是溶氧量過高，反而使產(chǎn)量下降[13]。本試驗考察了不同轉(zhuǎn)速對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響，試驗結(jié)果見表5。

表5 轉(zhuǎn)速對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響Table 5 Effects of rotation to 2,3-butanediol

由表5可知：不同的搖床轉(zhuǎn)速對2,3-丁二醇的產(chǎn)量有很大的影響。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速控制在125 r/min，2,3-丁二醇的產(chǎn)量最大。

2.6 初始木糖濃度對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響

木糖質(zhì)量濃度也會對發(fā)酵有較大影響，試驗結(jié)果見表6。

表6 初始木糖濃度對2,3-丁二醇產(chǎn)量的影響Table 6 Effects of xylose concentration to 2,3-butanediol

從表6中本試驗結(jié)果可以看出，初始木糖濃度較低時，木糖利用率較高；而當(dāng)初始木糖質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時，木糖利用率明顯下降，可能是菌體生長受到一定的抑制作用[14]。隨著初始木糖質(zhì)量濃度的升高，2,3-丁二醇的得率先增加后減少，在80 g/L時達(dá)到最大，為0.45 g/g，確定為最佳木糖發(fā)酵濃度。

2.7 L9（34）正交試驗

由單因素優(yōu)化試驗可知，pH值、溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速對木糖發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇影響較大，因而選取這4個因素進(jìn)行L9（34）正交試驗。每一試驗條件重復(fù)3次，共27組試驗，2,3-丁二醇產(chǎn)量取3組試驗產(chǎn)量的平均值，試驗設(shè)計及結(jié)果分析見表7、表8和表9。

表7 正交試驗因素水平表Table 7 The levels of factors table of orthogonal experiment

表8 正交試驗的極差分析Table 8 The analysis of range of orthogonal experiment

從表7的直觀分析和表8的F值可知，4因素對木糖發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇影響的顯著性次序為：轉(zhuǎn)速＞pH值＞溫度＞裝液量。4因素的最佳配比為A2B2C1D2，即pH為6.0、溫度為35℃、裝液量為80 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速為120 r/min。根據(jù)方差分析，pH值、溫度和轉(zhuǎn)速都是影響較為顯著的因素。

表9 正交試驗方差分析Table 9 The analysis of variance of orthogonal experiment

注：**代表極顯著。

表10 驗證試驗結(jié)果Table 10 Results of identification experiment

表10為在最佳配比A2B2C1D2的條件下對木糖產(chǎn)2,3-丁二醇的發(fā)酵條件進(jìn)行重復(fù)性驗證試驗，2,3-丁二醇平均濃度可達(dá)33.0 g/L，試驗結(jié)果高于預(yù)試驗和正交設(shè)計優(yōu)化9個試驗號，從而證明了優(yōu)選發(fā)酵條件的合理性。驗證試驗結(jié)果都在95%置信區(qū)間內(nèi)，說明正交試驗有較高的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

1）利用木糖為底物生產(chǎn)2,3-丁二醇，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，使2,3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到33.0 g/L，為木質(zhì)纖維素的利用和開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

2）木糖單因素試驗結(jié)果顯示，木糖發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇存在底物抑制現(xiàn)象，可以通過流加底物補料發(fā)酵解決這個問題，從而2,3-丁二醇產(chǎn)量有望進(jìn)一步得到提高，同時提高了木質(zhì)纖維素的利用率。

[1]Syu MJ.Biological production of 2,3-butanediol[J].Appl Microbiol Biotechnol,2001,55：10-18

[2]Garg SK,Jain A.Fermentative production of 2,3-butanediol：a review[J].Bioresour Technol,1995,51：103-109

[3]Ji XJ,Huang H,Du J，et al.Enhanced 2,3-butanediol production by Klebsiella oxytoca using a twostage agitation speed control strategy[J].Bioresour Technol 2009，100：3410-3414

[4]Ji XJ,Huang H,Li S，et al.Enhanced 2,3-butanediol production by altering the mixed acid fermentation pathway in Klebsiella oxytoca[J].Biotechnol Lett 2008，30：731-734

[5]Frazer FR,Mc Caskey TA.Effect of components of acid-hydrolysed hardwood on conversion of D-xylose to 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae[J].Enzyme Miocrobil Technol,1991,13：110-115

[6]Zald Ivar J,Niel Sen J,Olsson L.Fuel ethanol production from lignocellulose：a challenge formetabolic engineering and process integration[J].Applied Microbiology Biotechnology,2001,56(1/2)：17-34

[7]紀(jì)曉俊,朱建國,高振，等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2,3-丁二醇的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工,2006,26(8)：23-27

[8]Chandrakant P,Bisaria VB.Simultaneous bioconversion of glucose and xylose to ethanol by Saccharomyces cerevisiae in the presence of xylose isomerase[J].Applied Microbiology Biotechnology,2000,53(3)：301-309

[9]Perez J,Munoz-Dorado J,de la Rubia T，et al.Biodegration and biological treatments of cellulose and lignin：an overiew.Int Microbiol,2002,5：53-63

[10]Ma C,Wang A,Qin J，et al.Enhanced 2,3-butanediol production by Klebsiella pneumoniae SDM[J].Appl Microbiol Biotechnol，2009，82：49-57

[11]伍時華,張健,方杰，等.地衣酚法定量測定發(fā)酵液中D-核糖的研究[J].廣西工學(xué)院學(xué)報,2000(4)：55-59

[12]Perlman D.Production of 2,3-butylene glycol from wood hydrolyzates[J].Ind Eng Chem,1944,36：803-804

[13]Perego P,Converti A.Effects of temperature,inoculum size and starch hydrolyzate concentration on butanediol production by Bacillus licheniformis[J].Bioresource Technology,2003,89(22)：125-131

[14]Goleau D,Laube VM,Martin SM.Effect of various atmospheric conditions on the 2,3-butanediol fermentation from glucose by Bacillus polymyxa[J].Biotechnology Letters,1985,7(1)：53-58

Optimization of Fermentation Conditions for 2,3-Butanediol from Xylose

HAN Ning-ning,XIAO Dong-guang*，ZHANG Cui-ying，HU Ya-li,LIN Kang
（Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

2010-04-28

天津科技大學(xué)自然科學(xué)基金，項目編號：20090401

韓寧寧(1983—)，女（漢），碩士研究生，研究方向：現(xiàn)代釀造技術(shù)。

*通信作者