王榮艷，賈麗，范筱京

（北京市理化分析測(cè)試中心，北京100089）

高效液相色譜法測(cè)定食品中非食用色素

王榮艷，賈麗，范筱京

（北京市理化分析測(cè)試中心，北京100089）

建立食品中的酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O染料殘留的高效液相色譜同時(shí)測(cè)定的方法，樣品通過(guò)提取之后，采用基質(zhì)固相分散法凈化，然后分別用乙醇和乙醇-氨水-水（7∶2∶1）分步洗脫，最后進(jìn)行HPLC分離、檢測(cè)。此方法的回收率平均為79%，酸性橙Ⅱ的檢出限為0.01 mg/kg、堿性橙2的檢出限為0.02 mg/kg，堿性嫩黃O染料的檢出限為0.01 mg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為3.53%。

酸性橙Ⅱ；堿性橙2；堿性嫩黃O；基質(zhì)固相分散；高效液相色譜法

Abstract：This paper described a newly developed High Performance Liquid Chromatography （HPLC）method for simultaneous determination of acid orangeⅡ、basic orange 2 and basic flavine O in foods.Samples were extracted,cleaner up through Matrix solid phase dispersion（MSPD）.The three forbidden food pigments were eluted by ethanol and ethanol-ammonia-water（7∶2∶1）respectively,and separation and detection by HPLC.The recoveries of methanol were 79%,the detection limit of acid orangeⅡ，basic orange 2 and basic flavine O was 0.01 mg/kg，0.02 mg/kg and 0.01 mg/kg separately.The relative standard deviation of this method was 3.53%.

Key words：acid orangeⅡ；basic orange 2；basic flavine O；Matrix Solid Phase Dispersion (MSPD)；High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O均為工業(yè)染料，用于染絲、麻、皮革等，這3種物質(zhì)均可以使人致癌，根據(jù)GB2760-2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，這3種物質(zhì)嚴(yán)禁作為食品使用。但不法商販利用其顏色鮮艷、著色穩(wěn)定、價(jià)廉的特點(diǎn)非法添加于豆制品中，使腐竹、豆皮的色澤光亮，欺騙消費(fèi)者，嚴(yán)重危害了廣大消費(fèi)者的身體健康[1]。目前，酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[2-4]，以及DB33/T 703-2008《食品和農(nóng)產(chǎn)品中多種堿性工業(yè)染料的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中采用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)堿性橙和堿性嫩黃O，尚未檢索到同時(shí)檢測(cè)酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的相關(guān)文獻(xiàn)，初步建立了用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定以上3種物質(zhì)的方法，該方法能快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢出酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O，可以滿足食品檢驗(yàn)的需要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HPLC系統(tǒng)配2998二極管陣列檢測(cè)器（Waters 2695）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA 4K15）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠RE52CS）；固相萃取裝置（Agela）。

甲醇、無(wú)水乙醇（色譜純）；無(wú)水硫酸鈉（分析純）；冰乙酸（分析純）；甲酸（分析純）；氨水（分析純）；高純水；酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)品（優(yōu)級(jí)純）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg堿性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并準(zhǔn)確定容到10 mL容量瓶，制成標(biāo)準(zhǔn)貯備液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用甲醇稀釋制成系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 提取

稱(chēng)取10.0 g粉碎均勻的豆制品，置于50 mL離心管中，加入3 g無(wú)水硫酸鈉和15 mL無(wú)水乙醇，搖勻，超聲提取30 min，然后以5000 r/min離心5 min，將上清液倒入雞心瓶中。殘?jiān)儆脽o(wú)水乙醇提取2次，重復(fù)上述步驟，合并上清液于雞心瓶中。將雞心瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50℃濃縮至近干。

1.2.2 凈化

用20 mL高純水溶解雞心瓶中物質(zhì)，加入1.5 g聚酰胺粉，混勻，60℃水浴放置30 min。將混合物置于底層墊有濾紙的10 mL注射器中制成萃取柱，如圖1所示。

使其液滴均勻滴下（必要時(shí)，可以在固相萃取裝置上操作），用10 mL無(wú)水乙醇洗脫，收集洗脫液Ⅰ于雞心瓶中；然后分別用10 mL高純水和10 mL甲醇/甲酸混合液（體積比6∶4）洗滌萃取柱，棄去洗滌液，再用無(wú)水乙醇/氨水/水混合液（體積比 7∶2∶1）洗脫，收集洗脫液Ⅱ于燒杯中。

1.2.3 濃縮定容

將盛有洗脫液Ⅰ的雞心瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50℃濃縮至近干，用甲醇溶解，并準(zhǔn)確定容至2 mL；將盛有洗脫液Ⅱ的燒杯置于沸水浴中蒸至近干，用水溶解，并準(zhǔn)確定容至2 mL。最后定容液過(guò)膜待測(cè)。

1.3 色譜分離條件

色譜柱：Agilent SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫：25℃；PDA檢測(cè)器（波長(zhǎng)范圍：350 nm～550 nm）；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。流動(dòng)相：甲醇：20 mmol/L乙酸銨溶液體積為65∶35。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

由于酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O 3種物質(zhì)的pH值有所不同，所以同時(shí)檢測(cè)3種物質(zhì)時(shí)流動(dòng)相選擇不能具有酸堿性，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用20 mmol/L的乙酸銨和甲醇作為流動(dòng)相，以及Agilent SB-C18，在等度條件下即可將3種物質(zhì)很好的分開(kāi)且峰形良好；用二極管陣列檢測(cè)器掃描350 nm～550 nm，發(fā)現(xiàn)在450 nm時(shí)酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O都有較好的峰形，如圖2。

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

由于乙醇具有較強(qiáng)的極性，酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O都能很好的溶于乙醇，且其對(duì)環(huán)境的污染小，故選擇乙醇作為提取液；由于聚酰胺粉具有較強(qiáng)的吸附性，所以采用其作為基質(zhì)固相分散劑，這樣染料會(huì)被聚酰胺粉吸附，減少食品中蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等物質(zhì)的干擾；由于酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的酸堿性不一樣，所以在用聚酰胺吸附之后用2種洗脫劑分步洗脫，最后用HPLC檢測(cè)，結(jié)果較好，如圖3所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

配制0.1 g/mL～20 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x，g/mL）作圖，得到酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的線性方程。酸性橙Ⅱ的線性方程為y=26576x+653.19，R2=0.9997，堿性橙2的線性方程為y=42361x+538.92，R2=0.9997，堿性嫩黃O的線性方程為y=51301x-2851，R2=0.9997。以信噪比S/N為3時(shí)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度確定檢出限，得到本方法對(duì)豆制品中酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O的檢出限分別為 0.01、0.02、0.01 mg/kg。

2.4 回收率和精密度試驗(yàn)

取樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn)，每個(gè)添加量做6個(gè)平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 1 The recovery tests for samples（n=6）

3 結(jié)論

首次采用高效液相方法同時(shí)檢測(cè)非食用色素酸性橙Ⅱ、堿性橙2和堿性嫩黃O，方法靈敏度高，用聚酰胺粉作為基質(zhì)固相分散劑凈化樣品，無(wú)須使用價(jià)格昂貴的固相萃取小柱，對(duì)結(jié)果干擾小，在實(shí)際工作中具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

[1]陳文,王正猛,吳曉蓉,等.單掃描極譜法連續(xù)測(cè)定食品中非食用色素酸性金黃和酸性大紅[J].食品科學(xué),2005,26(6)：210-212

[2]林欽.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定豆制品中的堿性橙和堿性嫩黃O染料[J].色譜，2007,25(5)：776-777

[3]劉寧,肖白曼,張劍峰.HPLC法測(cè)定食品中非食用色素酸性橙Ⅱ[J].中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2006,18(2)：104-105

[4]李亞森,潘英,陳艷.用HPLC法測(cè)定食品中酸性橙Ⅱ和酸性金黃的探討[J].職業(yè)與健康，2008,24(2)：123-124

High Performance Liquid Chromatography Method for the Determination of Inedible Pigment

WANG Rong-yan，JIA Li，F(xiàn)AN Xiao-jing
（Beijing Center for Physical and Chemical analysis，Beijing 100089，China）

2010-04-15

王榮艷（1982—），女（漢），碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全方向研究。