肖海峻，孟利前，楊新建，田錦，雷莉輝，曹允

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京102442）

苜蓿葉蛋白提取工藝參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)

肖海峻，孟利前，楊新建，田錦，雷莉輝，曹允

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京102442）

以水為溶劑，采用熱凝絮法分別研究水浴溫度、水浴時(shí)間、苜蓿切碎長(zhǎng)度、料液比、打漿時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對(duì)葉蛋白提取效果的影響；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用7因素2水平正交試驗(yàn)對(duì)苜蓿葉蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明，打漿時(shí)間、水浴時(shí)間、打漿的料液比、苜蓿切碎長(zhǎng)度、水浴溫度是影響苜蓿葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的主要因素。其最佳提取工藝參數(shù)是：打漿時(shí)間5 min，水浴時(shí)間為12 min，打漿時(shí)料液比為1∶5，苜蓿切長(zhǎng)為1 cm，水浴溫度為80℃，離心時(shí)間10 min，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min。該研究旨在探索苜蓿葉蛋白提取工藝參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)，為大規(guī)模生產(chǎn)苜蓿葉蛋白提供參考。

苜蓿；提取工藝；葉蛋白

Abstract:Using water as extracting solvent,the extraction effects of water temperature and heating time,alfalfa mincing length,the radio of water to alfalfa,pulping time,centrifugal rev and time were studied respectively；based on the single factor experiment,the orthogonal experiment 7 factors and 2 levels were used to research the optimal extraction processing parameters of leaf protein from alfalfa，the results showed that main factors which had an effect on the extracting rate and the contents of of leaf protein were pulping time,heating time,the radio of water to alfalfa,alfalfa mincing length and water temperature.Based on the analysis of above,the optimal extraction processing parameters of leaf protein from alfalfa as follows：pulping time of 5 minutes,heating time of 12 minutes,the radio of water to alfalfa of 5,alfalfa mincing length of 1cm,water temperature of 80℃,centrifugal rev and time was 10 min and 3000 r/min.The aim of this paper was to provide an basis for mass production of leaf protein.

Key words：alfalfa；extraction processing；leaf protein

葉蛋白泛指以新鮮的青嫩莖葉為原料，經(jīng)榨汁、絮凝、濃縮、干燥等工藝提取的一種富含蛋白質(zhì)的濃縮物（leaf protein concentration 簡(jiǎn)稱 LPC）[1]，由細(xì)胞質(zhì)蛋白、葉綠體內(nèi)的基質(zhì)蛋白及部分線粒體蛋白組成的混合物[2]。

苜蓿葉蛋白具有產(chǎn)量高、凝聚顆粒大、易分離、品質(zhì)好等特點(diǎn)，因而苜蓿是目前用于生產(chǎn)LPC的主要原料。苜蓿葉蛋白具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其氨基酸種類齊全而且組成比例較為平衡[3]，與聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的成人氨基酸模式基本相符,可作為兒童和成人的食用蛋白源和食品添加劑；苜蓿還具有極高的飼用價(jià)值，用苜蓿葉蛋白取代豬、家禽日糧中的部分乃至全部蛋白質(zhì)飼料或取代哺乳犢牛的部分全乳代用品時(shí),都能取得良好的飼養(yǎng)效果[4]；此外，苜蓿還具有抗衰老、抗腫瘤、治療關(guān)節(jié)炎、心血管病、肺氣腫、老年性白內(nèi)障等功效。葉蛋白提取之后的殘?jiān)芍苯幼鳛轱暳衔桂B(yǎng)家畜。由此可見(jiàn)，從苜蓿中提取葉蛋白不僅可以緩減當(dāng)前蛋白飼料資源短缺的局面，也是牧草深加工和綜合利用的有效途徑[5]。

近年來(lái)，對(duì)葉蛋白提取工藝參數(shù)的研究主要集中在料液比、汁液的pH、保溫的溫度及時(shí)間等方面[6-8]。在此基礎(chǔ)上又增加苜蓿切碎長(zhǎng)度、離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間及水浴時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行研究，考察蛋白質(zhì)提取工藝參數(shù)對(duì)葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率的影響，以獲得葉蛋白提取最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫花苜蓿，2008年5月種植于北京市大興區(qū)榆垡鎮(zhèn)，2009年6月份采集，清洗后于-5℃冷凍儲(chǔ)藏，測(cè)定其含水量為69%，粗蛋白含量為22.3%。

1.2 儀器

FA-2004N電子分析天平、pHS-3C酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；A-88組織搗碎勻漿機(jī)：金壇市醫(yī)療儀器廠；LD4-2低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SM-3X恒溫干燥箱：上海神模電氣有限公司；8002型恒溫水浴鍋：北京光明醫(yī)療機(jī)械廠。

1.3 方法

1.3.1 葉蛋白提取工藝

準(zhǔn)確稱取一定數(shù)量的苜蓿，將其切碎并按一定比例加水，用打漿機(jī)打漿，用2層紗布過(guò)濾，將得到的濾液在設(shè)置溫度下加熱凝絮，經(jīng)離心得到沉淀物葉蛋白，在烘箱65℃條件下烘干得到葉蛋白提取物，稱其質(zhì)量，具體的工藝流程如圖1。

圖1 葉蛋白提取工藝流程圖Fig.1 Technical process of extraction leaf protein from alfalfa

1.3.2 葉蛋白提取工藝考核指標(biāo)

以葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率2個(gè)指標(biāo)對(duì)葉蛋白提取工藝條件進(jìn)行研究，其計(jì)算公式[2]分別是：

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

1.4.1.1 水浴溫度對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響

水浴時(shí)間10 min，苜蓿切長(zhǎng)為2 cm，打漿時(shí)料液比為 1∶6（g/mL），打漿時(shí)間為 5 min，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min,離心時(shí)間為10 min，水浴溫度分別為60、70、80、90、100℃時(shí)測(cè)定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率。

1.4.1.2 水浴時(shí)間對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長(zhǎng)為2 cm，打漿時(shí)料液比為 1∶6（g/mL），打漿時(shí)間為 5 min，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min,離心時(shí)間為10 min，水浴時(shí)間分別為4、6、8、10、12 min時(shí)測(cè)定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率。

1.4.1.3 苜蓿切碎長(zhǎng)度對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響

水浴溫度為 80 ℃，打漿時(shí)料液比為 1∶6（g/mL），打漿時(shí)間為5 min，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min,離心時(shí)間為10 min，苜蓿切長(zhǎng)分別為 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 cm 時(shí)測(cè)定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率。

1.4.1.4 打漿時(shí)料液比對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長(zhǎng)為2 cm，打漿時(shí)間為5 min，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min,離心時(shí)間為10 min，水浴時(shí)間為 10 min，料液比分別是 1∶5、1∶6、1∶7 和1∶8（g/mL）時(shí)測(cè)定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率。

1.4.1.5 打漿時(shí)間對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長(zhǎng)為2 cm，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min,離心時(shí)間為10 min，水浴時(shí)間為10 min，料液比為 1∶6（g/mL），打漿時(shí)間分別為 3、5、7 min 時(shí)測(cè)定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率。

1.4.1.6 離心轉(zhuǎn)速對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長(zhǎng)為2 cm，離心時(shí)間為10 min，水浴時(shí)間為 10 min，料液比為 1∶6（g/mL），離心轉(zhuǎn)速分別為2000、3000、4000 r/min時(shí)測(cè)定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率。

1.4.1.7 離心時(shí)間對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響

水浴溫度為80℃，苜蓿切長(zhǎng)為2 cm，水浴時(shí)間為10 min，料液比為 1∶6（g/mL），離心轉(zhuǎn)速為 3000 r/min,離心時(shí)間分別為5、10、15、20 min時(shí)測(cè)定苜蓿葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率。

1.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，選用水浴溫度、水浴時(shí)間、苜蓿切碎長(zhǎng)度、料液比、打漿時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間7個(gè)參數(shù)進(jìn)行L8(27)正交試驗(yàn)，具體的正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表1；在該試驗(yàn)中分別選用葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率對(duì)葉蛋白提取工藝條件進(jìn)行分析，每一水平重復(fù)3次。

表1 葉蛋白提取試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of extraction experiments of LPC

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 水浴溫度對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響水浴溫度對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖2。

從試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖2）可以看出，隨著溫度的升高，葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率在增加，當(dāng)水浴溫度為80℃時(shí)，葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率均達(dá)到最大，此時(shí)再增加溫度，提取率的變幅不大，因此確定該試驗(yàn)中水浴溫度為80℃。

2.1.2 水浴時(shí)間對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響水浴時(shí)間對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，葉蛋白得率的量在增加，當(dāng)水浴時(shí)間超過(guò)10 min后，葉蛋白得率的量在減少，而蛋白質(zhì)提取率隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)在不斷增加，但超過(guò)10 min變幅不大，從降低成本的角度考慮，水浴時(shí)間應(yīng)該選10 min。

2.1.3 苜蓿切碎長(zhǎng)度對(duì)葉蛋白得率的影響

苜蓿切碎長(zhǎng)度對(duì)葉蛋白得率的影響見(jiàn)圖4。

從圖4可以看出，當(dāng)苜蓿切碎長(zhǎng)度從0.5 cm逐漸加長(zhǎng)時(shí)，葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率隨著增加，當(dāng)切碎長(zhǎng)度超過(guò)2 cm時(shí)，葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率下降。隨著切碎長(zhǎng)度的增加，苜蓿在打漿過(guò)程中的破碎程度逐漸降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能全部溶解出來(lái)，最終導(dǎo)致提取率降低。

2.1.4 打漿時(shí)料液比對(duì)葉蛋白得率的影響

打漿時(shí)料液比對(duì)葉蛋白得率的影響見(jiàn)圖5。

從圖5可以看出，葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率隨著料液比的增加而減少，在料液比為1∶5（g/mL）到1∶7（g/mL）之間變幅較小，從成本的角度考慮，料液比應(yīng)該選定為 1∶5（g/mL）更適宜。

2.1.5 打漿時(shí)間對(duì)葉蛋白得率的影響

打漿時(shí)間對(duì)葉蛋白得率的影響見(jiàn)圖6。

從圖6可以看出，打漿時(shí)間為5 min時(shí)，葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率均獲得最大值，在5 min以前，由于打漿時(shí)間短，細(xì)胞沒(méi)有充分破碎，因此獲得的蛋白質(zhì)量很少，當(dāng)打漿時(shí)間超過(guò)5 min時(shí)，也可能由于打漿時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞也隨著增加，因此也會(huì)造成蛋白質(zhì)數(shù)量減少。

2.1.6 離心轉(zhuǎn)速對(duì)葉蛋白得率的影響

離心轉(zhuǎn)速對(duì)葉蛋白得率的影響見(jiàn)圖7。

從圖7可以看出，葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率隨著轉(zhuǎn)速的增加而增加，當(dāng)離心轉(zhuǎn)速達(dá)到4000 r/min時(shí)，這2個(gè)指標(biāo)達(dá)到最大，因此在提取過(guò)程中可以選擇4000 r/min。

2.1.7 離心時(shí)間對(duì)葉蛋白得率的影響

離心時(shí)間對(duì)葉蛋白得率的影響見(jiàn)圖8。

從圖8可以看出，離心時(shí)間從5 min增加到10 min時(shí)，葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率變化較大，超過(guò)10 min時(shí)，兩者的增幅變化不大，因此可確定離心時(shí)間為10min。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 以葉蛋白得率為指標(biāo)對(duì)葉蛋白提取工藝進(jìn)行分析

正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析和方差分析結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 試驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 2 Experiment project and analysis results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

從表3可以看出，因素主次順序?yàn)椋篍-B-D-C-AG-F，對(duì)因素 E、B、D、C、A、G 和 F 進(jìn)行分析，確定優(yōu)水平為E2B2D1C2A1G1F2，即打漿時(shí)間為5 min，水浴時(shí)間為12 min，打漿時(shí)料液比為1∶5 g/mL，苜蓿切長(zhǎng)為1 cm，水浴溫度為80℃，離心時(shí)間10 min，離心轉(zhuǎn)速為3000 r/min為最優(yōu)方案。

2.2.2 以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)對(duì)葉蛋白提取工藝進(jìn)行分析

正交試驗(yàn)結(jié)果分析和方差分析結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表4 試驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 4 Experiment project and analysis results

表5 方差分析表Table 5 Analysis of Variance

由表5可以看出，因素主次順序?yàn)椋篍-B-D-A-CF-G，由表 2對(duì)因素 E、B、D、A、C、F 和 G 進(jìn)行分析，確定優(yōu)水平為E2B2D1A1C2F2G1，即打漿時(shí)間為5 min，水浴時(shí)間為12 min，水浴溫度為80℃，打漿時(shí)料液比為1∶5（g/mL），苜蓿切長(zhǎng)為 1 cm，離心轉(zhuǎn)速為 3000 r/min,離心時(shí)間為10 min為最優(yōu)方案。

在所選的7個(gè)參數(shù)中，打漿時(shí)間對(duì)葉蛋白得率和蛋白質(zhì)提取率的影響最大，這充分表明了細(xì)胞的破碎程度是影響著蛋白質(zhì)提取的重要因素，因此在提取蛋白的過(guò)程中，一定要把細(xì)胞充分破碎，是獲得高提取率的前提，打漿時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響其破碎程度。

其次為水浴時(shí)間和料液比，這也是影響蛋白提取率的2個(gè)因素。隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率在不斷增加，但也要注意不能水浴時(shí)間太長(zhǎng)，否則會(huì)提升成本；隨著料液比增加時(shí)，葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率在降低，當(dāng)料液比很低時(shí)會(huì)導(dǎo)致浸提不充分，從而影響提取效果，但當(dāng)料液比很高時(shí)，造成濃度很稀，蛋白質(zhì)凝集性差，也會(huì)造成蛋白質(zhì)提取效果不好的局面。

再次，對(duì)葉蛋白提取效率影響最小的2個(gè)因素是離心時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速，這可能與苜蓿葉蛋白凝聚顆粒大、易分離等特點(diǎn)有關(guān)，因此，為降低成本，可選用較低的轉(zhuǎn)速和較短的離心時(shí)間。

3 結(jié)論

從以上分析可以看出，采用葉蛋白得率及蛋白質(zhì)提取率這2個(gè)指標(biāo)對(duì)葉蛋白提取最佳工藝條件進(jìn)行分析的結(jié)果較為一致，因此確定打漿時(shí)間為5 min，水浴時(shí)間為12 min，水浴溫度為80℃，打漿時(shí)料液比為1∶5（g/mL），苜蓿切長(zhǎng)為 1 cm，離心轉(zhuǎn)速為 3000 r/min，離心時(shí)間為10 min為苜蓿葉蛋白最佳提取工藝條件。

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Experimental Study on Parameter Optimization of Extraction Process of Leaf Protein from Alfalfa

XIAO Hai-jun,MENG Li-qian,YANG Xin-jian,TIAN Jin，LEI Li-hui,CAO Yun
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442,China）

2010-06-20

北京市教委科技計(jì)劃面上項(xiàng)目（KM200900005007）-苜蓿葉蛋白提取技術(shù)研究

肖海峻（1966—），女（漢），副教授，博士，研究方向：植物種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用。