馬雪青，王永剛，周賢婧，趙虎彪，李昆鵬，馬建忠

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

馬鈴薯病毒研究新進展

馬雪青，王永剛，周賢婧，趙虎彪，李昆鵬，馬建忠*

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730050）

馬鈴薯病毒作為影響馬鈴薯產量的主要因素，備受研究者的青睞。國際上對馬鈴薯病毒結構、檢測手段的研究，逐漸從病毒形態(tài)學研究轉到病毒基因組學及功能組學的研究。伴隨著測序技術的不斷發(fā)展，目前已有14種馬鈴薯病毒全基因測序完成，對馬鈴薯病毒種屬鑒定、檢測技術、基因結構和功能、復制與轉錄、傳播及抗病毒的研究有了最新的進展。本文就上述研究給予總結，對14種馬鈴薯病毒進行了進化樹分析，同時對馬鈴薯病毒蛋白質組學和代謝組學進行展望。

馬鈴薯病毒，檢測，基因結構與功能，進化

Abstract：In recent years，potato virus as a main factor affecting potato yield are in the favor of researchers.Internationally potato virus have advanced from virus morphology study to genomics and functional genomics research.With the sequencing technology development，14 species of potato virus have had complete genome sequences now.And there are new advances in the potato virus research on species identification，detection，gene structure and function，the mechanism of replication and transcription，transmission and anti-virus and so on.This paper gives a summary of these studies，analyses the homology for 14 kinds of potato virus by phylogenetic tree，and gives an overview of the researches on proteomics and metabolomics applications in potato virus.

Key words：potato virus；detection；gene structure and function；evolutionary

馬鈴薯作為世界第四大糧食作物，僅次于小麥、水稻、玉米。它主要是通過塊莖無性繁殖，其產量在很大程度上取決于馬鈴薯“種子塊莖”的質量，但是由于馬鈴薯病毒的存在使其產量大大降低，直接造成巨大的經(jīng)濟損失。目前已知的感染馬鈴薯的病毒有40余種［1］，隨國家、地域分布而不同。造成世界范圍內馬鈴薯產量下降的馬鈴薯病毒主要有馬鈴薯卷葉病毒（potato leaf roll virus，PLRV）、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）（包括 NNTN株系）、馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）、馬鈴薯M病毒（potato virus M，PVM）、馬鈴薯A病毒（potato virus A，PVA）和紡錘塊莖類病毒。因此作為世界主要經(jīng)濟糧食作物之一，世界各國都建立自己的馬鈴薯研究院所，譬如設立在秘魯利馬隸屬于國際農業(yè)研究組（農研組CGIAR）的16個國際農業(yè)研究中心的協(xié)商小組之一的國際馬鈴薯研究中心（CIP）、英國馬鈴薯理事會、美國馬鈴薯協(xié)會等。馬鈴薯病毒的研究也成為各國研究的重點，馬鈴薯病毒的檢測技術愈來愈成熟、快捷、靈敏，同時某些馬鈴薯病毒的分子生物學用途也在引起科研單位的重視，并且先后對病毒進行亞單位乃至全序列進行了分析、克隆、構建與表達等，馬鈴薯抗病毒植物基因工程也在不斷的研究中。

1 馬鈴薯病毒檢測方法比較

自植物病毒發(fā)現(xiàn)以來，世界各地科學家們都在絞盡腦汁的思考適合的檢測方法。事實上，確實建立了許多適宜的檢測方法，能夠準確鑒定各種病毒，主要涉及到生物學測定、血清學測定、生理生化測定、電鏡技術、分子生物學技術等多種檢測手段。病毒的檢測方法要求迅速、準確、廉價。尤其是馬鈴薯作為世界第四大糧食作物，不斷遭受病毒的侵害，產量不斷下降。因此建立適合于馬鈴薯病毒的檢測方法也迫在眉睫，2006年Khaled Makkouk針對植物病毒檢測方法給了精確描述［2］?？傮w上可以歸納為三大類：生物學方法；免疫學方法；核酸介導的分子生物學方法以及各種方法的綜合應用。

1.1 生物學方法

生物學方法是植物病毒研究工作的基本環(huán)節(jié)，亦是準確診斷鑒定病毒的關鍵，曾在馬鈴薯植物病毒鑒定與檢測工作中起著重要作用。馬鈴薯病毒生物學檢測常規(guī)內容主要包括寄主范圍測定、鑒別寄主反應、病毒汁液鈍化溫度、稀釋限點、體外存活期等離體性狀測定和傳播途徑測定等，雖費時、費事，但對馬鈴薯病毒的生物學特性早期鑒定起到重要的作用。馬鈴薯病毒的生物學檢測策略見圖1。2003年吳凌娟［3］利用指示植物，通過接種、培養(yǎng)從形態(tài)學角度對馬鈴薯PVX的寄主范圍、癥狀表現(xiàn)進行了研究，文中充分體現(xiàn)了傳統(tǒng)分類鑒定方法的研究策略，雖然繁冗，但對早期病毒的形態(tài)學認識起到很重要的作用；2000年呂典秋［4］等通過摩擦接種馬鈴薯病毒PVX于普通煙上作為繁殖植物，利用PEG沉淀和差速離心技術分離提純了馬鈴薯病毒PVX；從一定角度對病毒的傳播途徑以及分離提純方法給予介紹。S.M.Paul Khurana［5］亦對馬鈴薯Y病毒的分類、傳播方式給予介紹。從中我們可以了解到PVY為馬鈴薯Y病毒屬數(shù)目最多的病毒，病毒基因變異是導致數(shù)目巨大的根本原因，而病毒傳播又是導致病毒基因重組及變異的主要原因。ICTV（The Universalvirus Datebase of the International Committee on Taxonomy of viruses）收錄了源于世界各地關于馬鈴薯病毒的研究，并且從起源、分類、形態(tài)學特征、生理生化性質等方面給予了敘述。自從1939年Kausche第一次應用電子顯微鏡把煙草花葉病毒粒體照相以后，電鏡技術的研究也突然增加起來，針對馬鈴薯病毒的電鏡圖片也隨之而來，見圖2［6］，使得對馬鈴薯病毒形態(tài)結構特征有了清楚的認識。馬鈴薯病毒生物學鑒定方法的應用使得人們從宏觀角度認識到病毒的基本特點、生理性質以及傳播途徑等，在一定角度上有助于人類進行病毒防御，間接提高了馬鈴薯等糧食作物的產量。

圖1 病毒生物學檢測策略

圖2 馬鈴薯病毒的電鏡圖片

1.2 免疫學方法

免疫學測定方法不僅可以用于病毒分類的鑒定，還可定量地測定病毒在寄主體內的分布，如馬鈴薯的幾種重要病毒的抗血清曾被用來測定馬鈴薯塊莖的帶毒率［7］。血清學反應主要是病毒外殼蛋白抗原決定簇的作用，將有血清關系的病毒歸在一個屬內，但是在同一病毒屬內也并不是所有病毒之間都有血清學關系，馬鈴薯Y病毒屬病毒之間血清學關系就比較復雜。免疫學測定的方法有沉淀法、凝結法、免疫擴散法、酶聯(lián)免疫吸附法、斑點免疫法、免疫電泳和免疫電鏡法等。目前主要集中在酶聯(lián)免疫吸附法ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）及其衍生方法如TIBA（Tissue blot immunoassay）、Quartz crystal microbalance（QCM）immunosensors等方面［8］。郭興啟等［9］報道了馬鈴薯Y病毒兩分離物的生物學和血清學特性、病毒粒體形態(tài)大小以及它們引起的寄主細胞病變特征等方面的差異。周艷玲［10］等論述了利用ELISA等方法對馬鈴薯Y病毒屬的檢測。R.P.Singh等論述了利用血清學方法分離鑒定了重組馬鈴薯PVY病毒［11］。劉衛(wèi)平等［12］采用快速法檢測了馬鈴薯PVX、PVY病毒；白艷菊等［13］應用快速DAS-ELISA同時檢測PVX、PVY、PVS、PVM、PLRV5種馬鈴薯病毒。常規(guī)ELISA中各種反應是在靜止狀態(tài)下進行的，而快速ELISA中各種反應是在振搖狀態(tài)下進行的?？焖俜ê统Ｒ?guī)法具有相同的陽性率和靈敏度，但精密度高于常規(guī)法，且所用時間遠遠少于常規(guī)法。1991年張國柱［14］用Dot-ELISA對馬鈴薯主要病毒PVX、PVY、PLRV進行了檢測，1993孟清等［15］用這種方法檢測了馬鈴薯PVX、PVY和PVS病毒。相較生物學鑒定方法，免疫學方法靈敏度高、特異性強、操作簡單、適用于大量田間樣品的檢測，是目前生產應用最便捷、使用最為廣泛的檢測技術。

1.3 核酸介導的分子生物學方法以及各種方法的綜合應用

以核酸介導的分子生物學病毒檢測方法主要建立在PCR（polymerase chain reaction）反應基礎上，包括RT-PCR（Reverse transcription-polymerase chain reaction）技術、核酸雜交（Nucleic acid hybridization）技術、測序技術等。主要步驟有核酸RNA的提??；引物設計與擴增、克隆；測序鑒定；雜交分析。RT-PCR檢測技術在馬鈴薯病毒分子檢測技術中應用最廣，具有簡單、快速、靈敏、特異性強、重復性好等優(yōu)點，僅用微量染病組織的汁液即可靈敏地檢測到病毒的存在。此類技術不僅可以在基因水平上為植物病毒的檢測提供更靈敏的手段，而且可與核酸序列分析結合，檢測基因序列的分子變異，分析病毒株系間的序列同源性比較親緣關系，為病毒的鑒定提供可靠依據(jù)。

目前該項技術已分別應用于PVY、PVA、PLRV、PVS、PVX等病毒的檢測中。2009年Hugh Barker等通過RT-PCR方法克隆了PVY病毒部分基因片段、同時利用測序、分析等手段鑒定了6種PVYO，PVYN和PVYNTN亞種病毒，有助于從基因到結構功能的進一步認識［16］。2006年J.Aramburu等對源于西班牙東北部39種PVY利用生物學、血清學及分子生物學手段進行鑒定，得出此類病毒的基因型多樣性、屬于不同亞種的結論［17］。2005年Ismail Abdullahi等對寄生在馬鈴薯體內病毒18S rRNA基因進行克隆、序列分析；建立了能同時檢測多種病毒的核酸微矩陣方法［18］。2000年K.-H.Pastrik利用多重PCR方法快速準確鑒定了馬鈴薯塊莖亞種病毒subsp.sepedonicus［19］。1999年L.Glais等根據(jù)病毒基因組5′末端序列多態(tài)性特點，利用PCR-RFLP（restriction fragment length polymorphism）方法鑒定PVY病毒亞種病毒，得出引起馬鈴薯塊莖壞死病毒PVYNTN屬于同一亞種的結論［20］。2002年葉明等［21］以及1998年H-L WEIDEMANN分別應用單酶-RT-PCR、RT-PCR方法對馬鈴薯紡錘體病毒進行了鑒定［22］。

總之，馬鈴薯病毒檢測技術經(jīng)歷了傳統(tǒng)生物學檢測技術、免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術三個階段。傳統(tǒng)生物學檢測技術準確、直觀、易于操作，但耗時長，已不能適應生產需要。免疫學檢測技術快速、靈敏，適用于大量樣品的檢測，但傳統(tǒng)免疫學技術中在抗血清的制備上還有很多不足。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，一些技術應用到馬鈴薯病毒檢測中將是必然趨勢。隨著RT-PCR技術及相應儀器的普及，將成為應用最廣泛、最有前途的病毒檢測技術。此外分子生物學技術與免疫學技術的結合推動了兩種技術的共同發(fā)展，直接通過單鏈抗體片段的篩選及抗體基因克隆及表達即可完成抗血清的制備，解決了傳統(tǒng)免疫學技術中的難以解決的抗原制備問題。能快速準確地鑒定馬鈴薯病毒分子。

2 馬鈴薯病毒的分子生物學研究

自從上世紀五十年代末期至今，馬鈴薯病毒的研究從一般的生物化學及生物物理的分析研究逐漸擴展到分子生物學領域的研究。一方面研究馬鈴薯病毒的形態(tài)學特征、生理生化性質、病毒蛋白和核酸的結構組成；另一方面又研究了核酸及蛋白的復制、轉錄、翻譯和侵染機制。同時，在此基礎上又不斷的衍生出針對馬鈴薯抗病毒的研究，包括馬鈴薯組織培養(yǎng)技術的研究、脫毒技術的研究、抗病毒基因工程馬鈴薯的培育等?？傊畜w現(xiàn)在三方面的研究基因結構及功能分析；生物系統(tǒng)進化分析；病毒傳染機制及抗病毒轉基因工程研究。

2.1 基因結構及功能分析

馬鈴薯病毒的研究主要經(jīng)歷了從宏觀形態(tài)學到微觀病毒基因復制、轉錄、翻譯機制以及結構功能研究兩個階段。病毒顆粒主要由核酸及蛋白衣殼兩部分構成，少數(shù)病毒衣殼部分還包括脂質。人們?yōu)榱私馕霾《窘Y構主要從核酸和蛋白兩部分進行研究。一方面利用物理學手段，另一方面主要通過病毒基因的克隆與表達，來解析蛋白的結構與功能。2009年Hui quan Liu等對病毒基因及結構研究策略給予系統(tǒng)介紹［23］，見圖3。2002年Tuija Kekarainen等通過構建基因文庫方法，研究了PVA病毒的基因組序列、結構及各部分功能，指出PVA結構包括5′NTR、HC-Pro、P3、C1、VPg、Nia-Pro、Nib、CP、3′NTR九部分，同時繪制了Genome-Wide Map of Sites Essential圖譜［24］。2008年 Amy Kendall等利用光纖衍射、低溫電子顯微技術、掃描透射電鏡進一步闡述了PVX的螺旋對稱性結構、核酸及蛋白的排布結構，蛋白亞基結構等［25］。2006年Xuehua Zhong等利用Isostericity Matrix及突變手段研究了馬鈴薯塊莖病毒（PSTV）RNA病毒的三級結構和基序，繪制了PSTV的二級結構及病毒復制過程圖譜，闡述了三級結構在病毒復制過程中所起的關鍵性作用［26］。

此外，分子克隆技術的日益成熟，使得人們不僅對病毒基因的結構與功能有了更深層次的理解，同時對病毒的復制轉錄機制也有了清晰的認識。2004年Richard H.Guenther等利用RNA基序矩陣、NMR以及計算機軟件分析等手段分析了RNA病毒的結構、對亞結構進行了結構與功能分析，指出RNA病毒的復制與轉錄是通過個別基序與核酸、蛋白相互作用來介導［27］。總之，依賴于RNA聚合酶的RNA病毒的復制、轉錄機制研究目前普遍認為由病毒自身基因組中的順式作用原件決定的［28-29］。2007年Victoria S.Korneeva和Craig E.Cameron研究了依賴于RNA聚合酶的病毒結構和功能間的關系，文中指出了病毒復制的忠實性、復制速度以及起始機制是由與核糖體結合部位的核苷酸殘基決定的［30］。2009年Helena Plchova，Noemi Cerovska等首次對源于捷克的VIRUBRA1/045（EU717545）、VIRUBRA 1/046（EU717546）和VIRUBRA 1/047（EU313202）PLRV基因組序列進行了分析，同時跟NCBI收錄的13種不同宿主的PLVR全基因組序列進行了比對分析，得出最高一致性為98.7%。指出PLRV基因組包括7個ORF和1個RAP，編碼8種蛋白，負責病毒復制、侵染、繁殖過程中的蛋白質裝配、銜接等作用，其中ORF 3和ORF 4為保守序列、ORF 0和RAP為可變序列［31］。

圖3 病毒基因及結構分析策略

2.2 生物系統(tǒng)進化分析

植物病毒的生物學分類迄今為止仍然是科學研究領域的一大難題，傳統(tǒng)的生物學鑒定方法不能快速準確地進行種屬鑒定。而且其進化關系的分析也比較困難，就馬鈴薯病毒而言，其實很早就存在，但是對它們的認識卻經(jīng)歷了較長的時間，而且部分馬鈴薯病毒分類很難界定，給其病理學研究帶來了一定困難。自從分子生物學方法的不斷更新、成熟，使得這一難題能夠簡便、快速、準確的解決。目前許多研究人員已經(jīng)克隆分析了來源不同的多種馬鈴薯病毒，在the National Center for Biotechnology Information（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫內可以檢索到1968種馬鈴薯病毒基因序列。為了分析其進化關系，可以從許多方面出發(fā)，總之要選取保守性強的片段進行比對分析建樹。2004年G.Stuart等從NCBI中挑選25種蕃茄叢矮病毒科病毒，分別選取聚合酶、病毒外殼基因和編碼外殼運動蛋白基因作為基準，進行比對分析，推測和鑒定了蕃茄叢矮病毒科病毒的發(fā)展進化史，同時對基因結構進行了系統(tǒng)分析，得出了準確的編碼功能蛋白的基因結構［32］。本文將14種已經(jīng)得到的完整基因組序列的馬鈴薯病毒利用CLC DNA Workbench 5.0軟件進行進化樹分析，得到基于馬鈴薯病毒全基因序列的Bootstrap Neighbor-Joining進化樹，見圖4。從圖中我們可以看出其種屬以及種屬間的進化距離等，能清楚地推測其發(fā)展進化史。

圖4 基于各種馬鈴薯病毒全基因序列構建的Bootstrap Neighbor-Joining進化樹

2.3 馬鈴薯病毒侵染機制及抗病毒轉基因研究

2.3.1 病毒侵染機制的研究 馬鈴薯病毒和其他侵染性的病原物一樣，由于它的寄生性及致病性，破壞人類賴以生存的農作物，馬鈴薯病毒結構簡單，而且有些病毒顆粒在結晶以后，尚能保持其繁殖能力，許多生物學家及生理學家都集中精力來研究其侵染機制，希望借此來破壞其侵染等特性。

目前普遍認為病毒的傳播主要是靠蚜蟲傳播，而其侵染植株主要是靠病毒顆粒的運動性引起的，而蚜蟲的傳播又與病毒顆粒的結構有關系，2008年Mónica Betancourt等指出PVY病毒的傳播除了要靠蚜蟲的傳播，同時還取決于PVY的結構，其作為結構簡單病毒相較結構復雜病毒更加容易被蚜蟲所攜帶，進行傳播。而病毒顆粒一旦進入健康植株，其侵染健康植株的特性又是由靠病毒在細胞間的運動所需要的自身編碼的運動蛋白來完成［33］。2003年Konstantin I.Ivanov等利用蛋白激酶CK2對Potyvirus屬PVA病毒外殼蛋白磷酸化，體外侵染植物，發(fā)現(xiàn)磷酸化作用在病毒侵染過程中其重要作用［34］。2002年Natalia E.Yelina等研究發(fā)現(xiàn)PVA病毒的長距離運動是靠自身編碼的運動蛋白Hcpro協(xié)助完成的［35］。2001年O.N.Fedorkin等采用突變技術對PVX中編碼外殼蛋白C端18個核苷酸殘基進行逐漸缺失，通過克隆突變基因，在煙草中表達分析。分析得出C端核苷酸殘基編碼蛋白質在病毒細胞間的運動過程中起關鍵性作用［36］。

馬鈴薯病毒屬病毒至今未確定專一的運動蛋白，有研究者通過病毒編碼區(qū)基因的突變體研究其在宿主體內的運動，研究表明突變體病毒粒亦可在植株體內運動，猜測運動蛋白的形成與宿主植物自身的結構組成有關系，植株體內的某些蛋白協(xié)助病毒顆粒運動。而且前者理論較為流行，因此要解除破壞其侵染特性，主要是靠破壞其運動性來完成。運動蛋白主要分布在外殼上，編碼外殼蛋白的基因的研究自然而然又成為研究焦點。世界各地研究人員相繼從不同來源的帶病植株體內克隆到病毒外殼蛋白基因，以期從根本上了解其性質，解除病毒侵染破壞性。2003年V.Brault等利用點突變的方法將編碼枯黃病毒外殼主要蛋白的7個S domain區(qū)進行突變，進而研究不同domain編碼蛋白對病毒顆粒的沉積、蚜蟲介導傳播的影響作用，研究表明病毒的侵染運動是靠各類蛋白相互協(xié)同作用完成的［37］。

此外也有人推測病毒運動蛋白可能參與胞間運輸，2007年Daniel Hofius等采用了酵母雙雜交系統(tǒng)方法、定點突變、綠色蛋白融合表達手段研究發(fā)現(xiàn)輔助PVY細胞間運動以及長距離運動是由自身基因的編碼運動蛋白和宿主細胞內某些蛋白的協(xié)同完成的。同時指出運動蛋白核心區(qū)的蛋白部分NtCPIPs在病毒的形成、運動過程中對胞間連絲的形成、沉積、侵染等方面起決定性作用［38］。

2.3.2 抗病毒轉基因植物的研究 近幾年來，人們對植物病毒的作用機制研究逐漸明確，主要是針對病毒外殼在傳播和侵染過程中作用的研究。主要集中在：利用植株自身抗病毒基因的研究［39-43］；針對病毒外殼蛋白的抗病毒的植株的培育［44-46］；利用基因沉默技術培育抗病植株研究［47］；馬鈴薯病毒作為一種新型載體在基因工程中的應用研究［48］。

3 總結與展望

隨著對馬鈴薯病毒基因組結構和功能的進一步深入研究，越來越多病毒的基因組測序完成，而且對基因功能的研究也不斷利用轉基因植物予以證實。世界各國已成功克隆出用于轉化馬鈴薯的病毒外殼蛋白基因、復制酶基因、蛋白酶基因、基因調控區(qū)序列、核酶cDNA以及其他各種基因約20余種；建立完善了致瘤農桿菌介導的馬鈴薯轉化技術；通過外殼蛋白介導、復制酶基因介導、表達基因調控區(qū)等多種途徑，獲得抗PVX、抗PVY、抗PVX和PVY、抗PVY和PLRV、抗PLRV、抗PSTV的轉基因馬鈴薯栽培種。同時對病毒的生活史、檢測技術、復制與表達、傳播機制又有了更清楚的認識，為有效地控制馬鈴薯病毒的發(fā)生和危害提供了理論依據(jù)。但仍有許多方面的問題有待深入研究，主要集中在：基因組的翻譯機制、后加工修飾及蛋白-蛋白作用的研究相對薄弱；與病毒結合的結構域的鑒定；病毒與宿主基因水平的互作研究，病毒基因編碼蛋白在病毒傳播中的研究；病毒侵染的調控機制研究等。

基于上述問題，植物病毒基因功能組學、蛋白質組學以及代謝組學的研究逐漸成為未來病毒研究的主要方向。目前蛋白質組學及代謝組學相關技術用于病毒研究主要集中在動物病毒方面的研究［49-50］，為植物病毒的研究奠定了基礎。因此，借助高通量、高分辨率的基因、蛋白功能分析技術，利用生物信息學分析手段，必將加快對植物病毒基因功能及蛋白結構域的分析，篩選與復制和感染有關的調控因子，有助于更深層面地了解植物病毒的生物代謝及與宿主的互作關系，病毒的生活周期等。從而為解決人類賴以生存的糧食作物病毒的侵害提供了新的途徑，有助于糧食作物增產，緩解世界糧食危機。

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Research advances of potato virus

MA Xue-qing，WANG Yong-gang，ZHOU Xian-jing，ZHAO Hu-biao，LI Kun-peng，MA Jian-zhong*
（College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

Q939.46

A

1002-0306（2010）10-0429-06

2009-10-12 *通訊聯(lián)系人

馬雪青（1983-），在讀碩士，從事植物分子生物學研究。