李新華，劉星波

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110161）

大豆發(fā)芽過程中酶的含量變化及營養(yǎng)變化研究

李新華，劉星波

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110161）

探討大豆發(fā)芽過程中脂肪氧化酶、內(nèi)源蛋白酶和游離氨基酸及部分營養(yǎng)物質(zhì)的變化情況。采用不同發(fā)芽時間的發(fā)芽大豆進行脂肪氧化酶和內(nèi)源蛋白酶含量的檢測和分析。結(jié)果表明：沈農(nóng)8號大豆中，脂肪氧化同功酶L-1的含量最高，在大豆發(fā)芽過程中，脂肪氧化酶的活性逐漸降低；內(nèi)源蛋白酶和游離氨基酸的含量變化基本一致；脂肪含量降低；維生素C含量增高。

大豆發(fā)芽，脂肪氧化酶，內(nèi)源蛋白酶，游離氨基酸，脂肪，維生素C

Abstract：The changes of lipoxygenase，endogenous protease，free amino acids and some changes in nutrients during the processing of soybean germination were studied through different germination time.The results showed that Shennong 8，soybeans，lipoxygenase isoenzymes L-1 content were the highest.In soybean germination processing，lipoxygenase activity gradually reduced，endogenous protease and free amino acid content were basically the same，fat content lowered，∨itamin C content increased.

Key words：soybean sprout；lipoxygenase；endogenous protease；free amino acids；fat；∨itamin C

大豆子葉中的貯藏物質(zhì)有蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，在種子萌發(fā)過程中它們提供氮源、碳源和能量。大豆蛋白質(zhì)含量高、構(gòu)成蛋白質(zhì)氨基酸平衡性好，是世界上最經(jīng)濟的食物蛋白質(zhì)來源，人類獲取植物蛋白60%來自于大豆。大豆經(jīng)發(fā)芽處理后，營養(yǎng)價值進一步提高，并可形成獨特的口感和風味。大豆種子的發(fā)芽是一個需要巨大能量的過程，種子中貯藏了富含化學能的有機物，發(fā)芽時轉(zhuǎn)化為容易被胚吸收的形態(tài)，這些變化必須有酶的作用。種子發(fā)芽時酶的活化是最明顯的現(xiàn)象。大豆子葉中的貯藏物質(zhì)有蛋白質(zhì)、脂肪等，種子萌發(fā)過程中它們提供氮源、碳源，故蛋白酶、脂肪酶對種子的萌發(fā)尤為重要。大豆脂肪氧化酶含有三種同功酶（L-1、L-2、L-3），分別由一對基因控制。現(xiàn)日本已經(jīng)選育出大豆種子單缺失、雙缺失和三缺失的品種［1］。本實驗主要對大豆中的三種脂肪氧化酶同工酶進行檢測分析，并對大豆發(fā)芽過程中脂肪氧化酶、內(nèi)源蛋白酶的活性進行測定，為合理開發(fā)利用大豆中的內(nèi)源蛋白酶和脂肪氧化酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 沈農(nóng)8號，沈陽農(nóng)業(yè)大學實驗田。

UV-1600分光光度計 北京普析公司；TGL-16C離心機 上海安亭儀器廠；DFT-100手提式高速中藥粉碎機 溫嶺市大德中藥機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆發(fā)芽 選取成熟、飽滿、沒有破損的大豆籽粒，用清水洗3遍，然后在室溫下浸泡過夜。浸泡后的大豆用水清洗1遍，然后放入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿下鋪1層紗布，大豆表面再蓋2層紗布。放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽實驗，每天用清水適當清洗。

1.2.2 發(fā)芽大豆粉的制備 分別取發(fā)芽時間為0、1、2、3、4d的萌動或發(fā)芽大豆，研碎后，鼓風干燥。然后用粉碎機粉碎，即可得到不同發(fā)芽時間的發(fā)芽大豆粉。

1.2.3 大豆提取液的制備 取不同發(fā)芽時間的發(fā)芽大豆粉100g于試管中，加入5mL蒸餾水，5mL硼酸緩沖液，振蕩30min，用濾紙過濾，硼酸緩沖液清洗三次，濾液在50mL容量瓶中定容，得到大豆提取液。

1.2.4 脂肪氧化酶同功酶的測定［2］

1.2.4.1 緩沖溶液的制備 硼酸緩沖液（0.2mol/L，pH9.0）：將11.1g NaCl和 3.8g Na2B4O7·10H2O 用蒸餾水定容至1.0L得到硼酸鈉緩沖溶液，用于L-1的測定。硼酸鈉緩沖溶液（0.2mol/L，pH6.0）：稱8.8gNaCl，6.0g NaH2PO4·H2O 和 0.9g Na2HPO4·H2O用蒸餾水定容至1.0L，用于L-2的測定。

硼酸鈉緩沖溶液（0.2mol/L，pH6.6）：稱 8.8g NaCl，5.2g NaH2PO4·H2O 和 1.8g Na2HPO4·H2O 用蒸餾水定容至1.0L，用于L-3的測定。

1.2.4.2 脂肪氧化同功酶的測定 分別取用于測定L-1、L-2、L-3的硼酸緩沖液2.975mL，加入亞油酸鈉0.025mL，大豆提取液30!L?？瞻讓φ諡榕鹚峋彌_液2.975mL，亞油酸鈉0.025mL。分別在234、238、280nm下測吸光度30min，得到OD變化最大值MAX（△OD/min）。標準曲線：pH9.0的硼酸緩沖液2.975mL，加入 5、10、20、30、40!L 脂肪氧化酶，亞油酸鈉0.025mL，在234nm下測吸光度30min。得到OD最大變化值 MAX（△OD/min），空白對照為pH9.0的硼酸緩沖液2.975mL，亞油酸鈉0.025mL。以OD最大變化值MAX（△OD/min）為橫坐標，脂肪氧化酶為縱坐標，作大豆脂肪氧化酶的標準曲線。

1.2.5 大豆發(fā)芽過程中脂肪氧化酶活性的測定 取不同發(fā)芽時間的大豆提取液30!L，pH9.0的硼酸緩沖液2.975mL，亞油酸鈉0.025mL，在234nm下測吸光度30min，得到OD最大變化值MAX（△OD/min）。

1.2.6 發(fā)芽大豆內(nèi)源蛋白酶活性的測定 取不同時間的發(fā)芽大豆粉0.1g溶于10mL 0.2mol/L pH7.5的磷酸緩沖液中溶解。取2mL溶液加入0.5%酪蛋白溶液2mL，37℃搖勻，反應20min，加入10%三氯乙酸4mL終止反應，3000r/min離心10min，取上清液，在275nm下測 OD值?？瞻讓φ眨好敢?mL（預熱至37℃），加入三氯乙酸4mL，0.5%酪蛋白溶液4mL，37℃下?lián)u勻反應20min，3000r/min離心10min，取上清液。以OD值為橫坐標，酪氨酸含量為縱坐標，制作標準曲線。每個樣品做三個平行。在37℃下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1!g的酪蛋白為1個酶活力單位。1酶活力單位（U/g）=（H×F）/（15×0.05），H為根據(jù)吸光值從標準曲線中查得的酪氨酸含量，!g/mL；F為酶液的最終稀釋倍數(shù)。

1.2.7 游離氨基酸的測定 茚三酮比色法。取發(fā)芽0、1、2、3、4d 的大豆粉 0.1g溶于 10mL 水中，置于25mL容量瓶中，加熱10min，室溫冷卻后4000r/min離心 10min，取上清液，加入 2%茚三酮溶液和pH8.04磷酸緩沖液4.0mL，混合均勻，于沸水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標線，搖勻。靜置15min后，在570nm波長下，以試劑空白為參比，測定其余各溶液的吸光度 A。以氨基酸的含量（!g/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.8 大豆發(fā)芽過程中脂肪含量的測定 采用索氏提取法。

1.2.9 大豆發(fā)芽過程中維生素C的測定 采用磷鉬酸法。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪氧化同功酶的測定

脂肪氧化同功酶的OD變化最大值 MAX（△OD/min）值如表1所示。

表1 脂肪氧化同功酶的OD變化最大值MAX（△OD/min）

由表1可以看出，沈農(nóng)8號的脂肪氧化酶活力以L-1、L-2為主，并且L-1的活力略高于L-2；L-3缺失，可以看出沈農(nóng)8號是L-3缺失品種。

2.2 大豆發(fā)芽過程中脂肪氧化酶活性的測定

發(fā)芽0、1、2、3、4d 的大豆粉脂肪氧化酶活力如表2所示。

表2 大豆發(fā)芽過程中脂肪化酶的活性變化

由表2可以看出，隨著大豆的發(fā)芽，脂肪氧化酶的活性逐漸降低，從大豆浸泡到大豆發(fā)芽第4d，脂肪氧化酶的活性降低了47.5%，這對開發(fā)低豆腥味食品有一定的參考作用。

2.3 大豆發(fā)芽過程中內(nèi)源蛋白酶活性的測定

不同發(fā)芽時間的大豆粉內(nèi)源蛋白酶活力如圖1所示。

圖1 大豆種子萌發(fā)過程中內(nèi)源蛋白酶含量的變化

由圖1可以看出，從大豆浸泡階段內(nèi)源蛋白酶活力開始逐漸增強，在發(fā)芽第3d活力有所降低，而后又略有升高。從大豆萌發(fā)的第3d，開始大豆芽生長較快，可能與內(nèi)源酶的活性有關，內(nèi)源酶的活性越高，為豆芽生長提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，豆芽生長越快。

2.4 大豆發(fā)芽過程中游離氨基酸的變化

大豆發(fā)芽過程中游離氨基酸含量變化如圖2所示。

圖2 大豆種子萌發(fā)過程中游離氨基酸含量的變化

由圖2可以看出，在大豆發(fā)芽的前2d（48h內(nèi)），游離氨基酸的含量不斷增加；在48h后，游離氨基酸含量出現(xiàn)降低的趨勢。分析認為，大豆萌動期，子葉中蛋白質(zhì)開始部分酶解成游離氨基酸，為發(fā)芽過程提供可供幼芽吸收的能量，發(fā)芽2d后，大豆胚根生長則導致氨基酸的進一步降解，到第4d，可能又有新的氨基酸合成。游離氨基酸的含量與內(nèi)源蛋白酶的活性也密切相關。

2.5 大豆發(fā)芽過程中脂肪含量的變化

大豆發(fā)芽過程中脂肪的變化如表3所示。

表3 大豆發(fā)芽過程中脂肪含量的變化（g/100g）

由表3可以看出，隨著大豆的萌發(fā)，脂肪的含量逐漸下降，這可能是由于一部分的脂肪轉(zhuǎn)化成了豆芽生長所需的能量。

2.6 大豆發(fā)芽過程中維生素C的含量變化

對大豆發(fā)芽過程中的維生素C的含量變化進行測定，結(jié)果見表4。

表4 大豆發(fā)芽過程中維生素C含量的變化（mg/100g）

由表4可以看出，在大豆發(fā)芽過程中維生素C的含量顯著增加。在未發(fā)芽的大豆中未檢出維生素C，而在發(fā)芽的第1d就增加到了4.34mg/100g豆芽，這也是大豆發(fā)芽的好處之一。

3 討論

3.1 脂肪氧化酶同功酶缺失的原因

脂肪氧化酶能催化大豆中的不飽和脂肪酸氧化，產(chǎn)生醛、酮等有害物質(zhì)，使大豆及其制品產(chǎn)生豆腥味，阻礙大豆在食品中的廣泛應用。而大豆中存在三種脂肪氧化酶同功酶，人們已經(jīng)通過控制基因等手段培育出某種同功酶缺失的品種。本實驗中未在沈農(nóng)8號中檢出L-3，說明沈農(nóng)8號為L-3缺失品種。脂肪氧化酶的活力L-1略高于L-2，測定L-1的活性作為大豆脂肪氧化酶變化的參照。

3.2 脂肪氧化酶活性降低的原因

已有研究表明，大豆的脂肪氧化酶會隨著種子發(fā)育而產(chǎn)生較大變化。在幼芽生長的初期通常都表現(xiàn)出很高的酶活性，隨著種子的萌發(fā)，活性逐漸降低。大豆發(fā)芽后脂肪氧化酶的活性降低了47.5%，這對開發(fā)低豆腥味的大豆食品有一定的參考價值。

3.3 內(nèi)源蛋白酶游離氨基酸含量的變化

大豆的內(nèi)源蛋白酶出現(xiàn)了兩個峰值，在第2d和第4d活性較高。內(nèi)源酶的活性與游離氨基酸的含量密切相關。焉華娟、郭順堂的研究表明［3］，在大豆萌發(fā)過程中，從浸泡內(nèi)源蛋白酶就開始啟動，在48h時達到峰值，這與游離氨基酸的含量變化基本是一致的。由此可見，在發(fā)芽大豆中蛋白酶控制著蛋白質(zhì)的降解。在48h后，大豆芽生長速度極快，導致了游離氨基酸被大量消耗，致使在48h后游離氨基酸的含量出現(xiàn)了降低趨勢。第4d，豆芽生長速度減慢，可能又有新的氨基酸生成。

3.4 大豆發(fā)芽過程中脂肪的變化

大豆萌發(fā)過程中脂肪的含量逐漸降低，可能是因為一部分脂肪轉(zhuǎn)化為大豆生長所需的能量或作為產(chǎn)生的新細胞的結(jié)構(gòu)構(gòu)成。大部分對大豆萌發(fā)過程中大豆的脂肪含量的變化研究結(jié)果大致相同。

3.5 大豆發(fā)芽過程中維生素C的含量變化原因

大豆發(fā)芽過程中維生素C的含量明顯增加。在未發(fā)芽的大豆中未檢出維生素C，而發(fā)芽后含量顯著增加，使大豆的營養(yǎng)價值有一定的提高。

4 結(jié)論

4.1 沈農(nóng)8號為L-3缺失品種，脂肪氧化同功酶的含量L-1略高于L-2。隨著大豆的萌發(fā)，脂肪氧化酶的活性明顯降低。發(fā)芽后脂肪氧化酶的活性降低了47.5%。

4.2 從大豆萌發(fā)，內(nèi)源蛋白酶就開始啟動，并且在第2d和第4d出現(xiàn)了峰值。內(nèi)源蛋白酶的活性與游離氨基酸的含量密切相關。本實驗表明，二者的變化趨勢基本一致。

4.3 隨著大豆的萌發(fā)，大豆中的脂肪含量逐漸降低。

4.4 在未發(fā)芽的大豆中未檢出維生素C，而大豆萌發(fā)后，維生素C含量逐漸升高。

［1］左進華，董海洲.大豆脂肪氧化酶研究現(xiàn)狀［J］.糧食與油脂，2007（9）：29-30.

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Study on changes of enzyme and nutrition during the processing of soybean germination

LI Xin-hua，LIU Xing-bo
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0149-03

2009-10-23

李新華（1955-），男，博士生導師，研究方向：糧食油脂與植物蛋白。