汪立平，馬相杰，冷向軍，趙 勇

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海海洋大學(xué)，省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海200090）

甘露寡糖對羅非魚腸道菌群的影響

汪立平1，馬相杰1，冷向軍2，趙 勇1

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.上海海洋大學(xué)，省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海200090）

考察飼料中添加自制酵母甘露寡糖、外購甘露寡糖和黃霉素對奧尼羅非魚腸道菌群的影響。實驗以平均初重20.04±0.13g的奧尼羅非魚為實驗對象，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.00%（對照組）、0.5%的自制酵母甘露寡糖、0.5%的外購甘露寡糖和8mg/kg黃霉素。傳統(tǒng)菌落計數(shù)結(jié)果表明，各添加劑都能明顯改變幼魚腸道中的乳酸桿菌和大腸桿菌的數(shù)量及比例，餌料中添加0.5%的自制酵母甘露寡糖更能優(yōu)化羅非魚腸道微生物的微生態(tài)環(huán)境。DGGE圖譜分析表明，自制酵母甘露寡糖、外購甘露寡糖、黃霉素的加入都改變了羅非魚原有的腸道微生物的微生態(tài)環(huán)境，其中自制酵母甘露寡糖對羅非魚腸道微生物的微生態(tài)影響更大。

羅非魚，甘露寡糖，腸道菌群，DGGE

Abstract：This research studied the effects of homemade yeast mannan-oligosaccharides，purchased mannanoligosaccharides and flavomycin on the intestinal flora of tilapia.The study focused on the average initial weight 20.04±0.13g of tilapia，the basic diets were formulated to contain 0.5%home-made yeast mannanoligosaccharides，0.5%purchased mannan-oligosaccharides and 8mg/kg flavomycin，respectively，and the control contained no mannan-oligosaccharides or flavomycin.The result from plate count method showed the number and portion of lactic acid bacteria and E.coli from intestinal tract of juvenile tilapia were significantly affected by different addictives.The intestinal microbial micro-ecological environment of juvenile tilapia was optimized by homemade yeast mannan-oligosaccharides.The DGGE fingerprint showed that the original tilapia intestinal microbial micro-ecological environment was changed by homemade yeast mannan-oligosaccharides，purchased mannan-oligosaccharides and flavomycin.In contrast to the other two addictives，homemade yeast mannan-oligosaccharides had more impact on the intestinal microbial micro-ecological environment of tilapia.

Key words：tilapia；mannan oligosaccharides；intestinal microflora；DGGE

近年來研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖不僅具有低熱、穩(wěn)定、安全、無毒等良好的理化性質(zhì)，還具有調(diào)整腸道和提高免疫等保健功能。畜禽飼料中添加甘露寡糖能明顯改善胃、腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)乳酸桿菌等有益菌的增殖，抑制大腸桿菌的增殖，大大降低了腹瀉率［1-4］。魚類消化道微生物易受餌料的影響［5-8］，而目前，在魚類餌料中添加甘露寡糖的研究較少，僅見鯉魚（Cyprinus carpio）［9］、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［10］等少數(shù)品種。由甘露寡糖在飼料中的應(yīng)用效果來看，甘露寡糖是抗生素的理想替代品。羅非魚是我國重要的出口水產(chǎn)品，其安全性和抗生素的替代品研究更為受到關(guān)注。除紅羅非魚外，目前尚未見甘露寡糖在羅非魚飼料中的研究報道。因此，本實驗以奧尼羅非魚（Oreochromis niloticus×O.aureus）為研究對象，通過在飼料中添加自制酵母甘露寡糖，并與市售甘露寡糖、黃霉素做比較，利用傳統(tǒng)菌落計數(shù)法和變性梯度凝膠電泳（Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）考察在羅非魚魚體生長過程中對羅非魚腸道菌群的影響，以期為抗生素的替代品提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

酵母甘露寡糖 取實驗室保藏的β-甘露聚糖酶菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中活化，按10%的接種量接種到1000L的三角瓶中，搖床培養(yǎng)（200r/min）48h，500r/min離心5min，去除雜質(zhì)，上清液于9000r/min、4℃下，離心10min，取上清液即粗酶液。酵母細(xì)胞壁100g加入94.5mL水和5.5mL酶液，調(diào)節(jié)pH到6.0，55℃水浴4.5h后，烘干后制成粉末備用；魚種 采用平均體重20.04±0.13g的奧尼羅非魚，選用規(guī)格一致、體質(zhì)健壯的個體，共240尾，隨機(jī)分配于12口缸中（4個處理組，每處理3個重復(fù)），每缸20尾魚；伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（EMB）、MRS瓊脂培養(yǎng)基（MRSA） 北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；DGGE-PCR引物 V3-2（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′），V3-3（5 ′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′） 由上海生工生物工程公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 養(yǎng)魚實驗設(shè)計 在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.0%（對照組）、0.50%自制酵母甘露寡糖（等量減少麥麩用量）、0.5%外購甘露寡糖、8mg/kg的黃霉素，共4個處理組，每處理3個重復(fù)。各種原料均過40目篩，攪拌均勻，擠壓機(jī)制成直徑2.0mm的半沉性顆粒飼料?；A(chǔ)飼料組成見表1。

實驗Ⅱ：在基礎(chǔ)飼料中添加，各種原料過60目篩。

表1 基礎(chǔ)飼料組成

1.2.2 實驗管理 實驗用魚飼養(yǎng)于12口自動充氣循環(huán)控溫的水族箱中（0.8m×0.5m×0.5m）。用基礎(chǔ)飼料馴化1周，待魚攝食正常后開始實驗，日投喂3次（8∶30，12∶30，15∶00），投餌率為體重的 3%～5%。實驗期間水溫 25±1℃，DO ＞5mg·L-1，NH3-N ＜0.3mg·L-1，晝夜充氣，共 30d。

1.2.3 大腸桿菌和乳酸桿菌的測定 取奧尼羅非魚，在無菌操作臺上進(jìn)行魚樣處理，將收集的魚腸道樣品0.5g放到滅菌處理的10mL離心管中，做梯度，稀釋倍比稀釋一直到10-7。用移液槍吸取適量稀釋度的樣品100μL，接種到選擇性培養(yǎng)基上涂勻，每個稀釋度做3個平行樣。在37℃條件下培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行記數(shù)（每克魚腸標(biāo)本的活菌數(shù)），取其平均值。剩余魚腸放在-20℃下備用。

1.2.4 魚腸道微生物總DNA的提取 精確稱取100mg魚腸道樣品置于滅菌處理的10mL離心管，按照文獻(xiàn)［11］提取腸道微生物總DNA，將提取的DNA樣品置于-20℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 DNA質(zhì)量檢測 0.8%瓊脂糖TAE buffer電泳EB染色凝膠成像儀觀察分析；核酸蛋白分析儀檢測總DNA濃度和純度。

1.2.6 PCR擴(kuò)增與變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析針對16S rDNA V3區(qū)片段的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，模板DNA約50ng。擴(kuò)增程序為94℃，5min、25 個循環(huán)（94℃，1min、56℃，1min、72℃，2min）后72℃、10min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色、凝膠成像儀觀察分析。PCR產(chǎn)物進(jìn)一步用變性梯度凝膠電泳（DGGE）分離。凝膠變性梯度為35%～55%，電壓為120V，電泳緩沖液為1×TAE，60℃電泳3h，用Sybergreen染色后凝膠成像儀觀察分析。

1.2.7 圖像處理及數(shù)據(jù)分析 利用NTSYS 2.10中的UPGMA做不同飼養(yǎng)條件下的腸道微生物菌群聚類分析。以Rf值為標(biāo)記，對DGGE圖譜條帶采用二態(tài)編碼，即有條帶存在的編碼為“1”，無存在的則編碼為“0”，利用 Jaccard［12］系數(shù)對不同飼養(yǎng)條件下的羅非魚腸道微生物菌群的相似性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗結(jié)果

由表2可知，用添加自制酵母甘露寡糖、外購甘露寡糖和黃霉素的飼料喂養(yǎng)羅非魚，對羅非魚腸道中的大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量有明顯的影響。在羅非魚餌料中添加0.5%的自制酵母甘露寡糖、0.5%的外購甘露寡糖和8mg/kg的黃霉素與對照組比較，分別使乳酸桿菌增加22.09%、23.69%和2.81%，使大腸桿菌分別減少了18.67%、18.53%和29.47%。

從乳酸桿菌與大腸桿菌的比值來看，飼料中添加酵母寡糖、外購甘露寡糖和黃霉素都能明顯改變?nèi)樗釛U菌在腸道中的比例，餌料中添加0.5%的自制酵母甘露寡糖組比值最高，與其它組比較更好地優(yōu)化了羅非魚腸道微生物的微生態(tài)環(huán)境。

2.2 魚腸道微生物總基因組總DNA的提取

圖1 羅非魚腸道微生物總DNA電泳圖

分別對實驗中羅非魚4個樣品的腸道微生物基因組總DNA進(jìn)行提取，如圖1，從電泳圖中看出，得到了清晰的魚腸道微生物總DNA條帶，且條帶在23000bp左右。結(jié)果見表3，提取的羅非魚腸道微生物總DNA的OD260/280在1.8左右，得到了較純的DNA樣品，濃度在50～90ng/μL之間，可以滿足PCR的要求。

表2 甘露寡糖對羅非魚生長中腸道微生物的影響

表3 羅非魚腸道微生物總DNA濃度和OD260/280值

2.3 魚腸道微生物16S rDNA的V3可變區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

以上述提取的微生物總基因組DNA為模版，用16S rDNA的V3可變區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均獲得200bp左右的特異性擴(kuò)增片斷，從圖2中來看，樣品都有較亮的擴(kuò)增條帶，本實驗的PCR擴(kuò)增條件是比較合適的，適合用于接下來的DGGE電泳分析。

圖2 羅非魚腸道微生物16S rDNA-V3區(qū)片段PCR擴(kuò)增圖譜

2.4 不同飼養(yǎng)條件下16S rDNA-DGGE指紋圖譜建立、聚類分析及相似系數(shù)分析

對實驗Ⅰ、Ⅱ中羅非魚腸道微生物16S rDNA V3區(qū)片段的DGGE指紋圖譜及聚類分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 羅非魚腸道微生物16S rDNA的PCR-DGGE指紋圖譜（左）及聚類分析（右）

由圖3可知，在羅非魚餌料中添加0.5%的自制甘露寡糖、0.5%外購甘露寡糖和8mg/kg黃霉素都會明顯改變羅非魚腸道微生物的微生態(tài)環(huán)境，說明魚腸道微生物易受餌料的影響，由聚類分析圖可以看出，0.5%的自制甘露寡糖、0.5%外購甘露寡糖相似度最高，達(dá)到0.86，屬于一類；對照組和黃霉素組相似度為0.68，屬于一類；兩類之間的差別較大。

由表5可知，不同飼養(yǎng)條件下的羅非魚腸道微生物相似系數(shù)分布范圍為0.47～1.00。對照組與自制酵母甘露寡糖樣、外購甘露寡糖樣和黃霉素樣的相似系數(shù)分別是0.51、0.59、0.68，屬于中等相似，說明羅非魚餌料中添加自制甘露寡糖、外購甘露寡糖和黃霉素都使羅非魚原有腸道微生物的微生態(tài)發(fā)生改變；自制甘露寡糖樣和外購甘露寡糖樣的相似系數(shù)為0.81，屬于極相似，說明自制甘露寡糖和外購甘露寡糖在改變羅非魚腸道微生物微生態(tài)的效果上相近；自制甘露寡糖樣與黃霉素樣相似系數(shù)為0.78，屬于極相似，說明0.5%的自制甘露寡糖添加量就能達(dá)到8mg/kg黃霉素添加量的效果，可以作為替代黃霉素的參考；外購甘露寡糖樣與黃霉素樣相似系數(shù)為0.47，屬于中等不相似，說明羅非魚餌料中添加0.5%的外購甘露寡糖和8mg/kg黃霉素對影響羅非魚腸道微生物的微生態(tài)效果上存在較大的差別。

表5 不同飼養(yǎng)條件下的羅非魚腸道微生物相似系數(shù)

3 討論

本研究表明，在羅非魚餌料中添加自制酵母甘露寡糖和外購甘露寡糖都能改變腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)乳酸桿菌有益菌的增殖，抑制大腸桿菌的增殖。這與甘露寡糖對豬、雞和牛腸道微生物菌群的影響結(jié)果相似。由實驗結(jié)果可知，在羅非魚餌料中添加0.5%的自制酵母甘露寡糖、0.5%的外購甘露寡糖比添加黃霉素更能優(yōu)化羅非魚腸道微生物的微生態(tài)環(huán)境。

在DGGE指紋圖譜中條帶的有無與亮暗代表不同的微生物的有無和數(shù)量的差異，由DGGE指紋圖譜和聚類分析結(jié)果可知，添加自制酵母甘露寡糖組、外購甘露寡糖組和黃霉素組與對照組比較，明顯有屬于自己的特有條帶和與對照組同一水平上不同亮度的條帶，說明自制酵母甘露寡糖、外購甘露寡糖、黃霉素的加入都明顯改變了羅非魚原有的腸道微生物的微生態(tài)環(huán)境。聚類分析結(jié)果顯示，添加自制酵母甘露寡糖組和外購甘露寡糖組最相近，與對照組距離較遠(yuǎn)，屬一類；添加抗生素組與對照組距離較添加自制酵母甘露寡糖組和外購甘露寡糖組較近，屬于一類。由相似系數(shù)表知，添加黃霉素組較添加自制酵母甘露寡糖組和外購甘露寡糖組與對照組的相似系數(shù)更大，說明黃霉素雖然明顯改變羅非魚腸道中乳酸桿菌和大腸桿菌的數(shù)量，但對羅非魚腸道的微生態(tài)影響較自制酵母甘露寡糖和外購甘露寡糖要小。

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Effect of mannan oligosaccharides on intestinal microflora of ti/apia

WANG Li-ping1，MA Xiang-jie1，LENG Xiang-jun2，ZHAO Yong1
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Ministry of Education，Shanghai Fisheries University，Shanghai 200090，China）

TS254.1

A

1002-0306（2010）10-0142-04

2009-10-09

汪立平（1968-），女，副教授，主要從事功能性低聚糖、飲料酒的科學(xué)與技術(shù)研究及豆制品精深加工研究。

上海市教育委員會項目（07ZZ137）。