吳亮亮，石雪萍，張衛(wèi)明

（1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210042；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

花椒總黃酮測定方法研究

吳亮亮1，2，石雪萍1，*，張衛(wèi)明1

（1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210042；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

通過紫外掃描比較了蘆丁和花椒提取物在硝酸鋁-亞硝酸鈉和三氯化鋁法兩種顯色體系條件下的吸收特性，結(jié)果表明，硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法更適合花椒中黃酮含量的測定。硝酸鋁-亞硝酸鈉法線性方程y=12.275x-0.0001，蘆丁濃度在0.00～0.06mg/mL范圍內(nèi)，濃度和吸光度呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997，測定的平均回收率為98.86%。并測定了不同品種花椒中黃酮類化合物的含量。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，適合作為花椒中總黃酮含量測定的主要方法，也可以用于花椒提取物質(zhì)量控制。

花椒，總黃酮，紫外-可見分光光度法

Abstract：The absorption characteristics of the rutin and Zanthoxylum extract in two chromogenic systems（A（lNO3）3-NaNO2chromogenic system and AlCl3chromogenic system）by U∨-∨is scanning method.The results showed that the A（lNO3）3-NaNO2chromogenic system was suitable to detect total flavonoids in Zanthoxylum.Linear equation of A（lNO3）3-NaNO2was y=12.275x-0.0001（R2=0.9997），the recovery of standard addition was 98.86%.The concentration of the Zanthoxylum from different areas was detected using this method.This method was easy to operate，fast and accurate，and it was suitable to detect the total flavonoids in Zanthoxylum.It could also be used on quality control of the Zanthoxylum extract.

Key words：Zanthoxylum；total flavonoids；U∨-∨is spectrophotometry

花椒（Zanthoxylum）屬蕓香科，全世界約有250種，其中在我國約有45種，13個(gè)變種。主要品種為青花 椒（Z schinifolium Sieb.et zucc）和 紅 花 椒（Z.bungeanum Maxim）［1］。花椒在我國常作為一種食品調(diào)味料使用，氣味辛香麻辣，被譽(yù)為“八大味”之一。也是一種傳統(tǒng)中藥材，具有溫中散寒、除濕、殺蟲、止痛等作用［2-3］。黃酮類化合物泛指兩個(gè)芳環(huán)通過三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物，基本結(jié)構(gòu)為C6-C3-C6，廣泛存在于植物界中，在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷，部分以游離形式存在［4］。目前報(bào)道的測定植物中總黃酮含量的方法主要是可見光分光光度法［5］，但測定花椒總黃酮含量的方法未見報(bào)道。本文采用硝酸鋁-亞硝酸鈉體系顯色，可見光光度法測定花椒中總黃酮含量，同時(shí)對不同產(chǎn)地的青花椒和紅花椒中總黃酮含量進(jìn)行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花椒 市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品鑒定所；乙醇、氫氧化鈉、九水合硝酸鋁、硝酸鈉 均為國產(chǎn)分析純；純凈水。

T6紫外/可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；KQ3200E型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JA3103N分析天平 上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵河南省太康科教儀器廠；高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取粉碎干燥的花椒粉2.0g，用60mL 60%乙醇作為溶劑，在30℃下超聲提?。ǔ暪β?150W；超聲時(shí)間 1h；超聲溫度25℃），經(jīng)抽濾，即得樣品液。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取105℃下干燥恒重的蘆丁純品20mg，用無水乙醇溶解，搖勻，定容至100mL，即得0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為貯備液備用。

1.2.3 顯色試劑制備 準(zhǔn)確稱取44g九水合硝酸鋁于燒杯中，用少量水溶解后轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，用純凈水定容，配成10%的溶液待用。分別配制5%的亞硝酸鈉和10%的氫氧化鈉溶液于試劑瓶中，待用。精密稱取AlCl31.34g，甲醇定容至100mL，配成0.1mol/L 的溶液［6-7］。

1.2.4 兩種黃酮的測定方法紫外掃描

1.2.4.1 亞硝酸鈉-硝酸鋁法 精密移取0.5mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液和花椒提取液于20mL的干凈試管中，另取5.0mL無水乙醇于一支試管中，各管均加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，混勻，放置6min；加10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加10%氫氧化鈉試液10mL，用乙醇補(bǔ)齊至20mL搖勻，顯色15min。以無水乙醇管為空白，在400～600nm波長下進(jìn)行紫外-可見掃描。

1.2.4.2 三氯化鋁法 精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.5mL與花椒提取液于20mL的試管中，加70%乙醇5mL稀釋，另取一只試管加入5mL 70%乙醇，各管均加入0.1mol/L AlCl32mL，并用純凈水稀釋至刻度，搖勻，顯色15min。以乙醇管為空白，在300～500nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別準(zhǔn)確吸取0.2mg/mL的蘆丁溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法顯色，在波長508nm處以第一管為空白測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制校正曲線。

1.2.6 樣品測定 精密移取0.1mL提取液于20mL的干凈試管中，另取5.0mL無水乙醇于一支試管中，各管均加5%亞硝酸鈉溶液1.0mL，混勻，放置6min；加10%硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加10%氫氧化鈉試液10mL，用乙醇補(bǔ)齊至20mL搖勻，放置15min。顯色穩(wěn)定后，分光光度法在最大吸收波長處以無水乙醇管為空白測定吸光度，并從校正曲線上讀取相應(yīng)的濃度（mg/mL），根據(jù)濃度計(jì)算花椒黃酮提取率。黃酮提取率的計(jì)算公式如下：

黃酮提取率（%）=提取液中的黃酮總量（g）/花椒原料量（g）×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種方法掃描結(jié)果

硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法和三氯化鋁顯色法是黃酮測定中常用的兩種方法。從圖1紫外-可見光掃描結(jié)果可以看出，花椒提取物在三氯化鋁顯色反應(yīng)體系進(jìn)行波長掃描結(jié)果表明，在410nm左右吸收峰比較小，和蘆丁對照品比較，吸收特性有很大差異；而硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色體系中，蘆丁和花椒提取液吸收峰幾乎重合，并且在508nm出現(xiàn)最大吸收峰，由此推測花椒提取物中含有較多的鄰二酚羥基的黃酮、黃酮醇、二氫黃酮等黃酮類化合物。由此可見，三氯化鋁顯色法不適用花椒中黃酮含量的測定。因此選擇硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色體系，508nm下對花椒黃酮進(jìn)行測定。

圖1 兩種顯色方法下蘆丁和花椒提取物的紫外可見掃描圖譜

2.2 校正曲線繪制

蘆丁在硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色體系中濃度與吸光度值關(guān)系如圖2所示，蘆丁在濃度為0～0.06mg/mL內(nèi)，與其吸光度呈良好線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為 y=12.275x-0.0001，相關(guān)系數(shù) R2=0.9997。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 重現(xiàn)性考察

精密稱取花椒粉（茂汶紅花椒）5份，每份2g，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法進(jìn)行測定。將吸光值代入圖2標(biāo)準(zhǔn)線，求得提取液中黃酮相應(yīng)濃度，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.45%，見表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)（n=5）

2.4 穩(wěn)定性考察

將提取的樣品（茂汶紅花椒），按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法，每隔5min測定一次吸光度，在15min內(nèi)，吸光值基本穩(wěn)定，RSD=1.29%，所以在此時(shí)間范圍內(nèi)穩(wěn)定性最佳，見表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.1mL已知黃酮濃度的樣品液（茂汶紅花椒）到5支干凈試管中，分別加入0.1mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，按照亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定吸光度，計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.6 四種花椒總黃酮含量比較

按照1.2.6方法對四種花椒提取液進(jìn)行總黃酮含量測定，茂汶紅花椒的總黃酮含量最高，達(dá)194.4mg/g，其次云南青花椒189.0mg/g，韓城紅花椒167.4mg/g，四川青花椒最少，為162.0mg/g。

3 討論

本文以蘆丁為對照品，硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法來測定花椒中總黃酮的含量，該法的原理是在待測物的水溶液中，加入亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉試液，鋁離子與黃酮類化合物3，4-二羥基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)顯色來進(jìn)行測定。

此方法進(jìn)行總黃酮的含量測定影響因素很多，其一，某些具有鄰二酚羥基類化合物也會(huì)和鋁離子絡(luò)合顯色，例如含多羥基的酚酸、有機(jī)酸類化合物，如咖啡酸、綠原酸等；其二，某些黃酮類成分與鋁離子絡(luò)合，不在500nm左右處有最大吸收，影響測定結(jié)果，使測定結(jié)果偏小；其三，某些總黃酮類化合物中不含或僅含有少量蘆丁，但是很多研究者仍然用蘆丁做對照品測定總黃酮含量，則測定結(jié)果與實(shí)際總黃酮含量會(huì)有差別，不能準(zhǔn)確定量。前期實(shí)驗(yàn)表明，花椒中含有大量的蘆丁成分（實(shí)驗(yàn)結(jié)果已另文發(fā)表）。紫外-可見光掃描結(jié)果也顯示，對照品和花椒樣品硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色后的吸收曲線幾乎重合，也進(jìn)一步說明了此方法的合理性與可行性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，花椒中含有生物類黃酮，不同產(chǎn)地的花椒，生物類黃酮含量有一定差異。對花椒中的黃酮進(jìn)行含量測定，為花椒進(jìn)一步開發(fā)生產(chǎn)純天然、無毒副作用及具有多功能保健和醫(yī)療作用的食品、藥品提供理論依據(jù)。本法以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉體系顯色，以508nm為測定波長測定花椒中的總黃酮含量，其加標(biāo)回收率和重現(xiàn)性均較好，可作為花椒總黃酮含量測定的方法。四種花椒總黃酮含量測定比較發(fā)現(xiàn)，總黃酮含量均在162.0mg/g以上，茂汶紅花椒黃酮含量最高，是作為后期花椒黃酮研究的首選材料。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1981.

［2］劉雄，闞建全，陳宗道，等.花椒風(fēng)味成分的提?。跩］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（12）：62-66.

［3］本草綱目［M］.重慶：重慶出版社，2006.

［4］嚴(yán)敏，唐筱露.黃酮類化合物抗病毒作用研究概況［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（9）：149-150.

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Study on the determination method of total flavonoids content in Zanthoxy/um by spectrophotometry

WU Liang-liang1，2，SHI Xue-ping1，*，ZHANG Wei-ming1
（1.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plant，Nanjing 210042，China；2.School of Food Science&Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，China）

TS201.2

A

1002-0306（2010）10-0372-03

2009-11-13 *通訊聯(lián)系人

吳亮亮（1986-），男，研究生，主要從事食品功能成分研究與開發(fā)。

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)課題（2006BAD06B02）。