洪 流，趙亞平

(上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海200240)

超臨界二氧化碳注入法制備葉黃素殼聚糖微粒

洪 流，趙亞平*

(上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海200240)

以殼聚糖粒子為載體，葉黃素為原料，采用超臨界二氧化碳注入法成功地制備了葉黃素殼聚糖微粒，考察了過程參數(shù)如溫度、壓力和時(shí)間對(duì)葉黃素在葉黃素殼聚糖微粒中負(fù)載量的影響。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，葉黃素負(fù)載量減小;隨著壓力的增大，葉黃素負(fù)載量增大。當(dāng)溫度為35℃，壓力為25MPa時(shí)，葉黃素負(fù)載量達(dá)到最大值。當(dāng)溫度和壓力一定時(shí)，時(shí)間由1h增至4h，葉黃素負(fù)載量也隨之增加。

超臨界二氧化碳注入法，葉黃素，殼聚糖粒子

Abstract:The chitosan microparticles loaded with lutein was prepared using supercritical CO2impregnation technology.The effects of process parameters on the loading of lutein in the microparticles，such as temperature，pressure and time were studied.Results showed the impregnation amount of lutein increased with pressure increased but decreased with temperature increasing.The impregnation amount of lutein reached maximum when temperature was 35℃ and pressure was 25MPa.When temperature and pressure were constant，the impregnation amount of lutein increased with time increasing from 1h to 4h.

Key words:supercritical CO2impregnation technology;lutein;chitosan particles

葉黃素是一種含氧的類胡蘿卜素，廣泛存在于香蕉、獼猴桃、玉米和萬壽菊中，葉黃素在人體內(nèi)自身不能夠合成，完全依賴飲食攝取，葉黃素具有多種生理功能，尤其以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用突出，受到廣泛的關(guān)注［1－4］。葉黃素屬脂溶性色素，對(duì)溫度、光照、氧氣等因素非常敏感，易被氧化，因此在目前工業(yè)應(yīng)用生產(chǎn)工程中，一般都是將葉黃素與具有生物相容性的聚合物載體制成微納米混合物，有助于增大葉黃素水溶解性、方便葉黃素產(chǎn)品的處理、控制葉黃素劑量和提高葉黃素的穩(wěn)定性［5－7］。目前主要有以下幾種方法:氣流粉碎、滾動(dòng)球磨、噴霧干燥、重結(jié)晶(溶劑蒸發(fā)法或液體抗溶劑法)，但這些方法都有如下一些缺點(diǎn):在制備過程中可能會(huì)破壞和降解葉黃素，并有有機(jī)溶劑殘留在葉黃素和聚合物載體當(dāng)中，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生很大的害處［7］。近幾年來，超臨界二氧化碳注入技術(shù)作為一種清潔、有效的技術(shù)已經(jīng)引起了很大的關(guān)注，超臨界二氧化碳由于低的臨界溫度和其惰性氣體性質(zhì)可避免破壞和降解熱敏性物質(zhì)，通過改變過程參數(shù)溫度、壓力和時(shí)間方便控制調(diào)節(jié)熱敏性物質(zhì)的劑量，且無需使用有機(jī)試劑，不需要任何的后續(xù)操作，如干燥，溶解清除等等，大大節(jié)省了時(shí)間和提高了效率［8－10］。殼聚糖是甲殼素脫乙?；蟮漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性、生物黏附性和多種生物活性，無毒無免疫原性，可被體內(nèi)多種酶生物降解，其降解產(chǎn)物無毒，且能被人體完全吸收，這些特點(diǎn)使殼聚糖成為一種理想的藥物載體材料［11－12］。本工作采用超臨界二氧化碳注入法，以殼聚糖粒子為載體，葉黃素為原料，制備葉黃素殼聚糖微粒，考察了過程參數(shù)溫度、壓力和時(shí)間對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響，通過改變過程參數(shù)，制備不同葉黃素負(fù)載量的葉黃素殼聚糖微粒，為葉黃素作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑和天然色素在制藥工業(yè)和食品中的應(yīng)用提供新方法和新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖(脫乙酰度≥90%)，冰醋酸(≥99.5%)、三聚磷酸鈉(TPP)、氫氧化鈉 均為分析純，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葉黃素 80%，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;二氧化碳?xì)怏w 純度為99.9%，上海瑞利化工氣體有限公司。

JSM－7401F型場(chǎng)發(fā)射掃描式電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社;SP－752PC型紫外可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司;超臨界注入反應(yīng)儀器 由實(shí)驗(yàn)室組裝，反應(yīng)儀器如圖1所示。

圖1 超臨界注入裝置流程圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖粒子的制備 參照文獻(xiàn)［13－15］的方法進(jìn)行殼聚糖粒子的制備，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:稱取0.3g殼聚糖溶于100mL醋酸(體積分?jǐn)?shù)1%)，磁力攪拌子攪拌4h使殼聚糖充分溶解后，滴加0.5mol/L的氫氧化鈉溶液至殼聚糖醋酸溶液中，調(diào)節(jié)溶液pH為5.50，一邊攪拌，一邊向溶液中逐滴滴加三聚磷酸鈉溶液(1g/L)100mL，繼續(xù)攪拌30min，經(jīng)過高速離心后，除上層清液。將沉淀層用去離子水洗滌三次后，冷凍干燥得固體殼聚糖粒子。

1.2.2 超臨界二氧化碳注入 將過量的葉黃素和所制備的殼聚糖粒子(用0.45μm過濾膜包裹住)分別放入圖1中注入釜6的不同層，葉黃素放在注入釜6的最底層，殼聚糖粒子放在注入釜6的中層，打開閥門2、4、8、9，通入二氧化碳排除系統(tǒng)裝置內(nèi)的空氣后，關(guān)閉閥門9，將系統(tǒng)裝置密封。使用高壓泵3打入定量的二氧化碳，當(dāng)達(dá)到所需的壓力和溫度時(shí)，關(guān)閉閥門2、4，打開閥門8，立即開動(dòng)循環(huán)泵5，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，關(guān)閉循環(huán)泵5，打開閥門9，緩慢泄壓至常壓，從注入釜6的中層取出樣品待分析。研究了過程參數(shù)溫度、壓力和時(shí)間對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響，實(shí)驗(yàn)方案如表1所示。

表1 超臨界注入過程實(shí)驗(yàn)條件

1.2.3 葉黃素殼聚糖的鑒定和形貌測(cè)試 對(duì)殼聚糖粒子、超臨界二氧化碳注入的樣品和純?nèi)~黃素分別用照相機(jī)拍攝外觀形貌，并用JSM－7401F型場(chǎng)發(fā)射掃描式電子顯微鏡對(duì)超臨界二氧化碳注入的樣品進(jìn)行觀察。

1.2.4 葉黃素負(fù)載量的測(cè)試 利用紫外測(cè)試并計(jì)算負(fù)載的葉黃素質(zhì)量，具體步驟如下:取50mg超臨界二氧化碳注入的樣品，用定量無水乙醇超聲溶解，使負(fù)載的葉黃素充分溶解，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)試，并用下面公式計(jì)算葉黃素負(fù)載量:

2 結(jié)果與分析

2.1 葉黃素殼聚糖的鑒定和形貌分析

對(duì)葉黃素殼聚糖形成前后的形貌拍攝，如圖2所示。由圖片對(duì)比可知，殼聚糖粒子為純白色(a)，純的葉黃素顏色為橘黃色(c)，而經(jīng)過超臨界二氧化碳注入的樣品顏色均勻，呈黃色(b)，可知葉黃素已經(jīng)成功地注入至殼聚糖當(dāng)中，且分散均勻。此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證超臨界制備的葉黃素殼聚糖的形貌，本文采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)葉黃素殼聚糖的形態(tài)進(jìn)行了表征，如圖3所示，所制備的葉黃素殼聚糖顆粒大小均在微米范圍之內(nèi)，因此采用超臨界二氧化碳注入法可以成功地制備出葉黃素殼聚糖微粒。

圖2 殼聚糖粒子、葉黃素殼聚糖微粒與葉黃素外觀對(duì)比圖

圖3 葉黃素殼聚糖微粒的SEM圖

2.2 過程參數(shù)對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響

2.2.1 溫度對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響 保持壓力P分別為15、20、25MPa和時(shí)間2h不變，考察了溫度對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響，如圖4所示。

當(dāng)溫度由35℃升高至45℃時(shí)，葉黃素負(fù)載量均減少。依據(jù) Kazarian和其同事報(bào)道［16－17］的超臨界注入技術(shù)有兩種機(jī)理，第一種機(jī)理是在系統(tǒng)泄壓過程當(dāng)中，溶解在超臨界流體當(dāng)中的溶質(zhì)析出，從而將沉積在基質(zhì)載體當(dāng)中;第二種機(jī)理是由于溶解在超臨界流體當(dāng)中的溶質(zhì)與基質(zhì)載體之間的作用力(如范德華力)，導(dǎo)致溶質(zhì)在基質(zhì)載體當(dāng)中沉積。依據(jù)文獻(xiàn)中［18－20］葉黃素的溶解度與注入結(jié)果對(duì)比可知，該注入過程屬于第二種機(jī)理，說明葉黃素與殼聚糖粒子之間的作用力的影響對(duì)負(fù)載過程起重要的作用，隨著溫度的升高，葉黃素與殼聚糖粒子之間的作用力減弱，葉黃素負(fù)載量隨之減小。綜合上述得出超臨界二氧化碳的溫度變化可導(dǎo)致葉黃素負(fù)載量的變化，葉黃素負(fù)載量隨著溫度的增大而減小，當(dāng)溫度為35℃時(shí)，葉黃素負(fù)載量最大。

圖4 溫度對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響

2.2.2 壓力對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響 保持溫度為35、40、45℃和時(shí)間2h不變，考察了壓力對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響，如圖5所示。

圖5 壓力對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響

超臨界二氧化碳?jí)毫τ?0MPa上升到25MPa時(shí)，葉黃素負(fù)載量均有不同程度的增加，這是因?yàn)槌R界二氧化碳?jí)毫ι撸涿芏仍龃?，葉黃素在超臨界二氧化碳的溶解度提高，超臨界二氧化碳滲透能力也隨著提高，可將更多的葉黃素注入到殼聚糖粒子中，從而提高葉黃素負(fù)載量，同時(shí)圖5中還可以看出，在溫度分別為35、40、45℃時(shí)，壓力為15MPa時(shí)，葉黃素注入量之間的差距較大，當(dāng)壓力為25MPa時(shí)，葉黃素注入量之間的差距很小。分析可知隨著壓力的升高，葉黃素的注入量之間差距逐漸縮小，超臨界二氧化碳的壓力變化對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響較大。

2.2.3 時(shí)間對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響 保持溫度為35℃不變，分別考察了壓力為20MPa和25MPa時(shí)，時(shí)間對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響，由圖6所示。

當(dāng)壓力分別為20MPa和25MPa時(shí)，葉黃素負(fù)載量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。超臨界注入過程是由熱力學(xué)和傳質(zhì)學(xué)相互作用的過程，這一過程和壓力、溫度密切相關(guān)，壓力和溫度不僅可以改變?nèi)~黃素的溶解度和傳質(zhì)速度，還可以改變?nèi)~黃素在殼聚糖和超臨界二氧化碳的分配系數(shù)。在壓力為20MPa和25MPa，溫度為35℃時(shí)，葉黃素在超臨界二氧化碳的溶解度非常低，影響了葉黃素向殼聚糖粒子的傳質(zhì)速度，使得葉黃素達(dá)到平衡濃度的時(shí)間較長(zhǎng)，因此時(shí)間由1h增至4h，葉黃素注入量隨之增加。

圖6 時(shí)間對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響

3 結(jié)論

采用超臨界二氧化碳注入法，制備了葉黃素殼聚糖微粒，研究了溫度、壓力和時(shí)間對(duì)葉黃素負(fù)載量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)時(shí)間一定，葉黃素負(fù)載量隨溫度升高而減小，葉黃素負(fù)載量隨著壓力的增加而增加，當(dāng)溫度為35℃，壓力為25MPa時(shí)，葉黃素負(fù)載量達(dá)到最大值;當(dāng)溫度和壓力一定時(shí)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，葉黃素負(fù)載量也有不同程度的增加。超臨界二氧化碳注入法操作過程簡(jiǎn)單，無需使用有機(jī)試劑，是一種清潔、方便和有效的綠色方法。

［1］張莉華，許新德，陳少軍，等.微膠囊葉黃素理化性質(zhì)及其穩(wěn)定性研究［J］.中國食品添加劑，2007(1):92－95.

［2］張靜，唐粉芳，張?zhí)燧?，?葉黃素對(duì)小鼠免疫功能影響的研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28(12):193－195.

［3］Jaspreet K，Chug－Ahuja，Joanne M，et al.The development and application of a carotenoid database for fruits，vegetables and selected multicomponent fruits［J］.Journal of the American Dietetic Association，1993，93(3):318－323.

［4］Alisa Perry，Helen Rasmussen，Elizabeth J.Xanthophyll(lutein，zeaxanthin)content in fruits，vegetables and corn and egg products［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2009，22(1):9－15.

［5］齊金峰，熊華，陳振林，等.不同微膠囊化方法對(duì)葉黃素微膠囊性能的影響［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(1):65－71.

［6］F Miguel，A Martín，F(xiàn) Mattea，et al.Precipitation of lutein and co－precipitation of lutein and poly－lactic acid with the supercritical anti－ solvent process［J］.Chemical Engineering and Processing:Process Intensification，2008，47(9－10):1594－1602.

［7］A Martín，F(xiàn) Mattea，L Gutiérrez，et al.Co－ precipitation of carotenoids and bio－polymers with the supercritical anti－solvent process［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2007，41(1):138－147.

［8］MaraEM，Braga，MariaT，etal.Supercriticalsolvent impregnation of ophthalmic drugs on chitosan derivatives［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2008，44(2):245－257.

［9］LuigiManna，Mauro Banchero，Davide Sola，etal.Impregnation ofPVP microparticleswith ketoprofen in the presence of supercritical CO2［J］.The Journal of SupercriticalFluids，2007，42(3):378－384.

［10］Ana Rita C，Duarte，Jo?o F，et al.Preparation of chitosan scaffolds loaded with dexamethasone fortissue engineering applications using supercritical fluid technology［J］.European Polymer Journal，2009，45(1):141－148.

［11］石晶，鮑永利，烏垠，等.離子凝聚法制備負(fù)載流感疫苗的殼聚糖微球［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(11):2308－2311.

［12］劉偉，查晶，胡一橋.殼聚糖作為緩控釋輔料研究的最新進(jìn)展［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31(3):234－238.

［13］K A Janes，P Calvo，M J Alonso.Polysaccharide colloidal particles as delivery systems for Macromolecules［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2001，47(1):83－97.

［14］Quan Gan，Tao Wang，Colette Cochrane，et al.Modulation of surface charge，particle size and morphological properties of chitosan－ TPP nano－ particles intended for gene delivery［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces ，2005，44(2－3):65－73.

［15］黃小龍，張黎明.殼聚糖基載藥納米微粒制備研究進(jìn)展［J］.功能高分子學(xué)報(bào)，2003，16(4):593－598.

［16］SG Kazarian.Polymer processing with supercritical fluids［J］.Polymer Science，Ser C，2000，42(1):78－101.

［17］S G Kazarian，G G Martirosyan.Spectroscopy of polymer/drug formulations processed with supercritical fluids:in situ ATR－IR and Raman study of impregnation of ibuprofen into PVP［J］.International Journal of Pharmaceutics，2002，232(1 －2):81－90.

［18］Sandra Naranjo－ Modad，Agustín López－ Munguía，Gérard Vilarem，et al.Solubility of purified lutein diesters obtained from Tagetes erecta in supercritical CO2and the effect of solvent modifiers［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(11):5640－5642.

［19］AJ Jay，DC Steytler，M Knights.Spectrophotometric studies of food colors in near－ critical carbon dioxide［J］.The Journal of Supercritical Fluids，1991，4(2):131－141.

［20］Maria Salud Gómez－Prieto，Maria Luisa Ruiz del Castillo，Gema Flores，et al.Application of Chrastil＇s model to the extraction in SC－CO2of β－carotene and lutein in Mentha spicata L［J］.The Journal of Supercritical Fluids，2007，43(1):32－36.

Preparation of chitosan microparticles loaded with lutein using supercritical carbon dioxide impregnation technology

HONG Liu，ZHAO Ya－ping*
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China)

TS201.1

B

1002－0306(2010)08－0201－04

2009－08－31 *通訊聯(lián)系人

洪流(1984－)，男，碩士生，研究方向:超臨界流體的應(yīng)用。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z350)。