李曉英，董志國,，閻斌倫，程漢良，孟學(xué)平，沈和定，李家樂

（1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

青蛤POD組織差異及溫度驟升和窒息脅迫對青蛤POD的影響

李曉英1，董志國1,2，閻斌倫1，程漢良1，孟學(xué)平1，沈和定2，李家樂2

（1.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

研究了青蛤肝胰腺、鰓瓣、斧足、外套膜組織中過氧化物酶（POD）組織差異以及溫度驟升和窒息脅迫對青蛤POD酶活的影響。結(jié)果表明：水溫16℃和溫度驟升至32℃環(huán)境下青蛤POD酶活性均存在不同程度的組織差異性，且以肝胰腺中的POD活性最高，而斧足最低。水溫16℃環(huán)境下青蛤的肝胰腺、斧足、外套膜和鰓瓣這4個組織之間的POD酶活力除外套膜和鰓瓣無顯著差異外，其余均存在明顯的組織差異（P＜0.05）,其中肝胰腺的POD酶活最高1.68±0.08 U?mg-1，其次為鰓瓣、外套膜，而斧足中的POD活力最低0.19±0.02 U?mg-1。同時溫度驟升脅迫對青蛤的POD也有顯著的影響，在瞬時32℃高溫下5 h時肝胰腺的POD酶活達(dá)到最大值3.85±0.06U?mg-1，11 h時出現(xiàn)第二峰值3.47±0.22 U?mg-1，15 h后POD值達(dá)到處理前水平并逐漸趨于穩(wěn)定；在窒息環(huán)境脅迫下肝胰腺的POD酶活在15 h內(nèi)變化無顯著變化，與對照組水平接近，15 h-17 h酶活顯著升高，17 h達(dá)到最大值2.98±0.54 U?mg-1，之后又恢復(fù)到對照組水平。

青蛤；溫度驟升；窒息；過氧化物酶；組織差異

Abstract：The Peroxidase (POD)activity differences were comparatively studied in the four tissues,hepatopancreas,gill,foot and mantle of C.sinensis as well as the impact of sharp increase in water temperature and hypoxia on POD activity for the clam.The results showed that,either in 16℃ sea water or sharp increase to 32 ℃,there existed significant differences in specific activity of POD among four organs of the clam (P＜0.05,except between hepatopancreas and mantle).The POD had the highest activity1.68±0.08 U?mg-1in hepatopancreas while lowest 0.19±0.02 U?mg-1in foot in 16 ℃ sea water.After the increment of temperature to 32 ℃,the activity of POD amounted to the maximum of 3.85±0.06U?mg-1in 5 h and then declined,until 11h,the second peak of 3.47±0.22 U?mg-1appeared,and after that,the value recovered to untreated level and kept stable.Under the conditions of hypoxia,the activity of POD had no change in 15 h then sharply rose in 15 h-17 h and finally amounted to maximum of 2.98±0.54 U?mg-1in 17 h and later it returned to the level of control group.

Keywords：Cyclina sinensis; temperature increment; hypoxia; Peroxidase; tissue differences

貝類具有低等的免疫功能，主要通過細(xì)胞免疫和體液免疫來完成其免疫機制，而環(huán)境因子對貝類的抗氧化免疫酶活性有著顯著的影響，這在貽貝(Mytilus galloprovincialis)[1]、棕蚌(Perna perna)[2]和巖牡蠣(Saccostrea glomerata)[3]等得到了印證。過氧化物酶（POD）廣泛存在于動植物和微生物細(xì)胞的過氧化物酶體中。在動物中，過氧化物酶與吞噬功能和免疫細(xì)胞功能相伴[4-6]，起細(xì)胞黏附[7]、抗氧化[8-10]和氧化聚合對苯二酚成黑色素的功能[11]，在底棲海洋無脊椎動物中如貽貝和蛤類，過氧化物酶是主要的免疫酶類參與免疫調(diào)節(jié)[12-14]。

青蛤(Cyclina sinensis Gmelin)屬于瓣鰓綱(Lamelliranchia)、簾蛤科(Veneridae)，俗稱黑蛤、蛤蜊等，為暖水性亞熱帶種類，是中國沿海重要的經(jīng)濟(jì)貝類。青蛤的研究目前主要集中在繁殖與發(fā)育生物學(xué)[15-17]、遺傳[18,19]和生態(tài)[20,21]等研究方面。作者先后利用溫度驟升和窒息脅迫這兩個環(huán)境因子對青蛤免疫相關(guān)抗氧化酶類酸性磷酸酶（ALP）、溶菌酶（LSZ ）、超氧化物歧化酶（SOD）以及過氧化氫酶（CAT）的影響開展了研究[22,23]，而POD作為重要的抗氧化酶類在海洋貝類的組織器官分布規(guī)律和環(huán)境因子對其影響程度均未見相關(guān)報道。青蛤作為一種灘涂埋棲貝類，受潮汐規(guī)律影響，形成特殊的生態(tài)環(huán)境，特別是潮水漲落形成的棲息地環(huán)境溫度和溶解氧的顯著變化成為灘涂貝類的最主要生態(tài)因子；加之作為經(jīng)濟(jì)貝類，青蛤長途運輸中溫度和氧氣成為其存活的關(guān)鍵因子。因此，從免疫水平上揭示高溫和低氧環(huán)境對青蛤過氧化物酶的作用規(guī)律，查明其組織分布規(guī)律，對于青蛤的免疫生理、種質(zhì)鑒定、灘涂養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)和活體運輸保存等均具有重要的科學(xué)意義和實踐意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用青蛤為2008年5月取自連云港海區(qū)的自然群體，選取個體規(guī)格基本一致2齡蛤100枚，殼長（29.32±2.53）mm。采集到的青蛤活體快速運到實驗室后暫養(yǎng)于水產(chǎn)養(yǎng)殖控溫循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)（大連匯新公司），自然海水控溫16℃,鹽度 23，水槽中鋪沙4-5 cm，連續(xù)充氣不投餌，適應(yīng)7 d后開始試驗。

1.2 酶液的制備

組織差異試驗中青蛤每個處理取 5枚，準(zhǔn)確分離肝胰腺、外套膜、斧足、鰓瓣，液氮中研磨呈粉狀，粉狀組織轉(zhuǎn)移入2 ml的離心管內(nèi)，稱重。加冷生理鹽水，體積為組織塊重量的9倍，將制備好的10% 勻漿在高速冷凍離心機 12 000 r/min離心10 min。取上清液進(jìn)行測定或放于 -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗條件的設(shè)定

1.3.1 溫度驟升 取暫養(yǎng)青蛤的海水，利用加熱棒和控溫儀加熱海水并維持在 32 ℃，隨機選取暫養(yǎng)的青蛤，分別處理3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h、15 h、24 h，以未作處理的青蛤為對照。試驗期間的其它環(huán)境條件、飼養(yǎng)管理同暫養(yǎng)期。達(dá)到試驗時間后，每個處理時間隨機選取5個樣本提取酶液。

1.3.2 窒息條件處理 加熱煮沸海水，維持沸騰狀態(tài)，直至將海水中的氣泡驅(qū)除干凈。迅速用液體石蠟封住液面，將實驗海水與空氣隔離，使海水中溶氧始終保持在低氧水平。經(jīng)碘量法測定溶氧低于0.2 mg·L-1。利用冷水浴將實驗海水冷卻并保持在16 ℃。隨機選取暫養(yǎng)的青蛤輕輕放入，注意保持液面封閉，分別處理3 h、5 h、7 h、9 h、11 h、13 h、15 h、17 h、19 h、23 h、27 h，以未作處理的青蛤為對照。試驗期間除停止充氣外，其它環(huán)境條件、飼養(yǎng)管理同暫養(yǎng)期。達(dá)到試驗時間后隨機選取5個樣本提取酶液。

1.4 測定指標(biāo)及方法

POD的測定采愈創(chuàng)木酚法[24]。1 mL酶液在1 min內(nèi)氧化物1 μg愈創(chuàng)木酚為1個酶的活力單位，以上測定均按試劑盒（南京建成生物研究所）說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將結(jié)果輸入 MS-Excel 2003 進(jìn)行計算并繪制曲線，采用STATISTICA 5.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Tukey HSD多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蛤4組織中過氧化物酶活性表達(dá)差異

青蛤4種組織中POD酶活結(jié)果見圖1。由圖可知青蛤在未受高溫應(yīng)激處理前，即對照組（16 ℃）青蛤的肝胰腺、斧足、外套膜和鰓瓣在4組織中的POD酶活力除外套膜和鰓瓣無顯著差異外，其余均存在明顯的組織差異（P＜ 0.05），其中肝胰腺的POD酶活最高1.68 ± 0.08 U?mg-1，其次為鰓瓣、外套膜，而斧足中的 POD活力最低 0.19 ± 0.02 U?mg-1；而試驗組青蛤在32 ℃高溫下應(yīng)激3 h后，4組織中POD活力大小關(guān)系基本與對照組的一致。仍然是肝胰腺的 POD 酶活力最高達(dá) 2.33 ± 0.12 U?mg-1，斧足依然為最低0.10 ± 0.01 U?mg-1。因此，常溫和高溫應(yīng)激條件下青蛤 POD存在明顯的組織差異性，且以肝胰腺中的POD活性最高，而斧足最低。

2.2 溫度驟升對青蛤POD的影響

將青蛤由水溫16 ℃的環(huán)境下瞬時置于32 ℃的水環(huán)境中，不同處理時間組POD的酶活結(jié)果見圖2。由圖2可見青蛤在32 ℃水中經(jīng)過不同時間的高溫處理，其肝胰腺中過氧化物酶的活性發(fā)生了明顯的變化。其中高溫處理5 h時過氧化物酶的活性達(dá)到最大值3.85 ± 0.06 U?mg-1，5 h之后出現(xiàn)明顯下降，一直持續(xù)到 9 h，11 h時出現(xiàn)第二峰值3.47±0.22 U?mg-1，之后逐漸下降，恢復(fù)至初始值。方差分析結(jié)果表明，在 24 h內(nèi)，有高溫應(yīng)激處理5 h和 11 h達(dá)到最大峰值，二者無明顯差異（P＞0.05），而與其它時間內(nèi)的POD酶活均存在顯著差異。需要指出的是除5 h和11 h 這兩個時間的酶活力達(dá)到最大，7-9 h處于過渡期或波動期，其余時間的 POD酶活基本上維持在初始狀態(tài)，酶活無顯著差異（P ＞ 0.05）。從起始到5 h間過氧化物酶的活性顯著增高，表現(xiàn)出高溫脅迫引起青蛤肝胰腺中過氧化物酶的大量表達(dá)，并在11 h達(dá)到最大后在13 h恢復(fù)到試驗前的水平，表現(xiàn)出青蛤?qū)Ω邷氐闹饾u適應(yīng)性。

圖1 青蛤POD酶活的組織差異Fig.1 POD activity in four organs of C.sinensis

2.3 低氧窒息環(huán)境對青蛤過氧化物酶的影響

青蛤由正常條件下（水溫16℃，連續(xù)充氧）瞬時置于無氧窒息水環(huán)境中，不同處理時間組 POD的酶活結(jié)果見圖3。由圖3可見經(jīng)過不同時間的低氧處理，青蛤肝胰腺中的POD酶活在17 h時極劇增加達(dá)到了最大值 2.98 ± 0.54 U?mg-1，從處于窒息狀況起始到 15 h之間 POD酶活無明顯變化(P ＞0.05)，酶活與對照組水平接近(圖3中的0 h值)，15 h到17 h間POD酶活顯著升高（與其它時刻均為P ＜ 0.05），表現(xiàn)出窒息條件脅迫下機體POD的生理功能。17 h之后POD酶活出現(xiàn)下降回到與對照組相同的水平（POD酶活在19 h后與15 h前的相同均為P ＞ 0.05）。上述結(jié)果說明青蛤受到低氧窒息脅迫時在一定程度上機體可以表現(xiàn)出明顯的抗性，而持續(xù)一段時間后則又表現(xiàn)出很強的適應(yīng)性，機體POD酶活又恢復(fù)到正常水平。

圖2 溫度驟升后青蛤肝胰腺POD的酶活性Fig.2 POD activity of hepatopancreas after sharp increase of temperature

圖3 窒息條件下青蛤肝胰腺POD酶活Fig.3 POD activity of hepatopancreas in suffocation state

3 討 論

3.1 青蛤4組織中過氧化物酶的組織差異

一些免疫酶類常具有組織表達(dá)差異，作為生化遺傳標(biāo)記在種質(zhì)鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)分析中發(fā)揮了重要的作用，如 SOD[25]，POD[26]等。本研究結(jié)果顯示POD在青蛤4組織中存在酶活差異，常溫和高溫應(yīng)激條件下均存在明顯的組織差異性。青蛤在未受高溫應(yīng)激處理前，肝胰腺、斧足、外套膜和鰓瓣這4個組織之間的POD酶活力以肝胰腺活力最高為1.63 ± 0.08 U?mg-1，其次為鰓瓣、外套膜，而斧足中的過氧化物酶活力最低為0.19 ± 0.02 U?mg-1；青蛤在32 ℃高溫下應(yīng)激3 h后，其4個組織中POD活力仍然存在明顯的組織差異（P ＜ 0.05），其中肝胰腺的POD 活力仍然最高為 2.38 ± 0.12 U?mg-1。因此，過氧化物酶在青蛤中存在明顯的組織差異性，且它的活力在肝胰腺中最高，這可能與不同組織器官生理功能不同有關(guān)。楊軍峰等（2007）[27]在對斑鱖和翹嘴鱖不同組織中過氧化物酶的比較研究實驗中發(fā)現(xiàn)，POD具有種間特異性，可以作為鱖魚分類鑒定的依據(jù)，同時也具有組織特異性，經(jīng)電泳結(jié)果分析過氧化物酶在魚體不同組織里表達(dá)的差異比較明顯（肝臟、腎、腦等），這與本論文的研究結(jié)果具有一定的相似性。一般雙殼貝類的肝胰腺主要作為消化器官，內(nèi)有大量的酶類，可能也是主要的免疫酶的產(chǎn)生器官。這種表達(dá)差異可以作為雙殼貝類的一個典型的生理生化指標(biāo)，進(jìn)一步開展青蛤生理生態(tài)研究，將肝胰腺組織作為研究環(huán)境脅迫對青蛤過氧化物酶影響目標(biāo)組織器官具有一定的可行性。

3.2 高溫與低氧環(huán)境脅迫對青蛤過氧化物酶的影響

過氧化物酶（POD）在自然界中廣泛分布，在動物、植物、微生物中都扮演著重要的角色，它也是動植物細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)中的一種，與動植物抵御極端溫度、干旱、重金屬脅迫、病害等各種不良環(huán)境有著密切的關(guān)系。POD活性變化作為生物體內(nèi)重要的生理指標(biāo)，同時也是生物響應(yīng)逆境環(huán)境的重要標(biāo)志，可以作為監(jiān)測環(huán)境脅迫的生物指標(biāo)[28]。對于 POD的組織差異及其影響其活性的因素研究在海洋生物如魚類和蝦蟹類中研究較少，相關(guān)研究僅見H2O2、pH、硫氧嘧啶、氰化物因子對攀鱸（Anabas testudineus ）頭腎中體外環(huán)境下 POD活性影響的研究，結(jié)果顯示單獨將H2O2量達(dá)到1.2 μmoles/混合液,或者pH為5.5時酶活均達(dá)最高值，而硫氧嘧啶、氰化物均有抑制作用[29]。本研究測定了高溫和低氧條件下 POD在青蛤體內(nèi)環(huán)境下活性的變化，結(jié)果表明，青蛤在受到高溫和低氧等環(huán)境脅迫后，分別在0 h到5 h和0 h到17 h內(nèi)均出現(xiàn)過氧化物酶活力的顯著提高，體現(xiàn)了環(huán)境脅迫對過氧化物酶的影響。劉應(yīng)迪(2001)研究了濕地匍燈蘚（Plagiomium acutum）和大羽蘚（Thuidium cymbifolium）在不同的高溫脅迫條件下 POD活性及其與處理時間和處理溫度的關(guān)系，結(jié)果表明，在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，POD活性增加。在一定溫度條件下，一般隨著處理時間的延長，POD活性增加。但是當(dāng)超過一定的溫度（45-50℃）以及一定的處理時間（4-6 h），POD活性有所下降[30]。對另一植物文冠果（Xanthoceras Sorbifolia）的研究認(rèn)為 POD酶活性上升是在高溫脅迫下細(xì)胞受損，組織細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生和消除的平衡被打破，使得活性氧產(chǎn)量增加[31]。對龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）研究發(fā)現(xiàn)溫度的上升既可引起活體內(nèi) POD酶活力的上升，也可明顯提高提純后的離體POD酶活力，表明龍須菜POD對溫度的響應(yīng)既可能是基因轉(zhuǎn)錄水平上對酶蛋白合成的誘導(dǎo)，也可以直接作用于蛋白質(zhì)水平上，引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)的變化從而導(dǎo)致活力的上升，因此龍須菜 POD對溫度脅迫表現(xiàn)出了非常特殊的響應(yīng)[28]。上述對植物研究結(jié)果與本試驗的結(jié)果有一些相似之處，但也存在了一些不同現(xiàn)象。青蛤在32 ℃高溫脅迫下在5 h時達(dá)到最大值之后逐漸下降，到9 h時又出現(xiàn)上升趨勢，11 h時出現(xiàn)第二峰值，之后再次下降，15 h時過氧化物酶的活性基本恢復(fù)，達(dá)到對照組水平，之后逐漸趨于穩(wěn)定。青蛤在 11 h時出現(xiàn)第二次峰值，之后再次下降并趨于平穩(wěn)，第二個峰值現(xiàn)象的出現(xiàn)我們推測可能是青蛤長時間在高溫脅迫下生命降低前所做的“垂死掙扎”。這種情況在徐鋼春（2007）研究環(huán)境脅迫對河蜆(Corbicula fluminea)酶活性影響所得結(jié)果類似[32]。本試驗中在低氧環(huán)境下青蛤在0 h到15 h之間過氧化物酶的活性與對照組水平接近，比較平穩(wěn)，而15 h到17 h間過氧化物酶的活性顯著升高，表現(xiàn)出低氧條件對過氧化物酶的誘導(dǎo)作用，17 h之后過氧化物酶的活性出現(xiàn)下降，表現(xiàn)出低氧的抑制作用。在低氧環(huán)境下過氧化物酶在15 h時才開始上升并在17 h時達(dá)到最高，這與在高溫環(huán)境 5 h就出現(xiàn)最高值相比推遲了很多，可能是在低氧環(huán)境下過氧化物酶對環(huán)境的反應(yīng)能力較遲緩。

相對于文蛤和雜色蛤子等簾蛤科經(jīng)濟(jì)種類，青蛤一般被認(rèn)為具有較強的環(huán)境耐受力，水體溫度和溶解氧含量等環(huán)境因子在一定的閾值范圍內(nèi)不會對青蛤的生命構(gòu)成威脅，但在不良環(huán)境因子長時間存在或當(dāng)環(huán)境突然惡化時，很可能會使群體的適應(yīng)力有所降低。本研究結(jié)果提示青蛤養(yǎng)殖、育種保種研究中盡量保持環(huán)境的相對穩(wěn)定，以免溫度及溶氧大幅度變化引起青蛤 POD產(chǎn)生明顯的波動，導(dǎo)致機體產(chǎn)生劇烈的反應(yīng)，影響自身的生存。

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Differences of peroxidase activity in four organs and the impact of sharp temperature increase and hypoxia on peroxidase activity in Cyclina sinensis

LI Xiao-ying1,DONG Zhi-guo1,2,YAN Bin-lun1,CHENG Han-liang1,MENG Xue-ping1，SHEN He-ding2，LI Jia-le2

(1.Key Laboratory of Marine Biotechnology of Jiangsu Province,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China;2.Aquatic and Life School,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Q554+.6; Q959.215

A

1001-6932(2010)05-0521-05

2009-08-18；

2010-02-08

農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)種質(zhì)資源與利用重點開放實驗室開放課題基金（KFT2008—4），江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室項目（HS2007004）和連云港市科技發(fā)展計劃（科技攻關(guān) CN0906）項目共同資助

李曉英 (1975－ )，女，碩士，實驗師，主要從事水產(chǎn)種質(zhì)資源與種苗工程研究。電子郵箱：dzg7712@sina.com.cn

李家樂，電子郵箱：jlli@shou.edu.cn