陳 軍，高貴珍，曹穩(wěn)根，馬傳喜

（1.宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，安徽宿州234000；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，安徽合肥230036）

小麥生產(chǎn)在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，其中面制食品是我國(guó)人民的主食之一。而在面制食品的加工和儲(chǔ)藏過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。有不少研究表明，小麥中多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是影響褐變的主要原因[1～3]。

PPO是一類廣泛分布于植物體內(nèi)能催化多酚類氧化成醌類的質(zhì)體金屬酶，它的底物（酚類物質(zhì)）存在于液泡中，且這種酶與底物的區(qū)域分布使得PPO在完整細(xì)胞內(nèi)的生理功能難以確定。生物體內(nèi)的PPO分布是不均勻的，具有時(shí)間和空間特異性。在小麥中，從幼苗到植株以及成熟籽粒中都含有多酚氧化酶，但種類及活性有所差異。一些研究表明，小麥籽粒中的PPO主要存在于麩皮層中，面粉中PPO活性隨著出粉率的增加而提高[4]，且不同小麥類型和品種間PPO均有一定差異；對(duì)同一品種而言，發(fā)育成熟的大籽粒PPO高于發(fā)育不完全的小籽粒。硬粒小麥多酚氧化酶活性最低，普通白粒小麥多酚氧化酶活性低于硬紅冬、硬紅春及軟紅冬小麥，但是硬紅冬和軟紅冬小麥、硬紅冬和硬紅春小麥間多酚氧化酶活性差異較小[5]。大量研究表明，成熟籽粒PPO主要存在于種皮中，胚中無(wú)PPO[6，7]，但小麥籽粒發(fā)育及萌發(fā)過(guò)程中PPO動(dòng)態(tài)性的變化規(guī)律還不是很清楚。

本研究選取不同類型小麥品種，對(duì)籽粒發(fā)育及萌發(fā)過(guò)程中PPO活性進(jìn)行研究，以期找出小麥籽粒PPO活性變化規(guī)律，為小麥PPO遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)育期供試材料為：安農(nóng)95081-8、安農(nóng)95083-6-1、安農(nóng) 0309、鄭麥 9023、安農(nóng) 9267 和煙農(nóng)19 6個(gè)品種，于2006—2007年種植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田。

萌發(fā)期供試材料為：宿麥553、徐麥856、皖麥 50、皖麥 52、煙農(nóng) 19、邯 6172、連麥 2號(hào) 7個(gè)品種，于2007—2008年種植于宿州市農(nóng)科所試驗(yàn)田。

以上材料均采用小區(qū)撒播種植，田間管理與大田一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 發(fā)育期籽粒的處理 各品種在盛花期選取同時(shí)開花且大小一致的200穗掛牌標(biāo)記。4月28日第1次取樣，每品種分別取15穗放于冷凍冰箱（-70℃）中待測(cè)。以后每隔5 d取樣1次，直至成熟收獲。

1.2.1.2 萌發(fā)期籽粒的處理 （1）每個(gè)品種稱取相同質(zhì)量的籽粒21份，每份1.000 g。（2）將上述樣品浸于一個(gè)培養(yǎng)皿里，于25℃、空氣濕度95%的人工可編程氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，且要定時(shí)翻動(dòng)籽粒。（3）萌發(fā)期分 7 個(gè)階段取樣，即 0，12，24，36，48，60，72 h（每隔 12 h取樣1次）。將培養(yǎng)好的小麥籽粒冰浴研碎備用。

1.2.2 PPO活性檢測(cè)方法

1.2.2.1 發(fā)育期籽粒PPO活性檢測(cè) 參照Anderson[8]和Morris[9]的方法。未成熟籽粒（干質(zhì)量為0.300 0 g）放于研缽中冰浴研碎后轉(zhuǎn)入50 mL小燒杯中；成熟籽粒用瑞典產(chǎn)旋風(fēng)磨制備全麥粉（過(guò)0.5 mm篩）。稱取0.300 0 g全麥粉放入50 mL小燒杯中，加入7.5 mL反應(yīng)試劑（50 mmol/L，pH=6.5的MOPS緩沖液；10 mmol/L L-DOPA，左旋多巴作為PPO反應(yīng)底物），恒溫水浴振蕩器上振蕩5 min（振蕩器速度設(shè)為100 r/min，溫度設(shè)為37℃），樣品充分暴露在空氣中，之后迅速將反應(yīng)后的樣品放在冰塊上終止反應(yīng)（1 min），并迅速混勻樣品，用中速定量濾紙進(jìn)行過(guò)濾。以反應(yīng)試劑（空白L-DOPA/MOPS，左旋多巴與MOPS的混合液）為對(duì)照，在475 nm下測(cè)定濾液的吸光度ΔA（ΔA為5 min內(nèi)吸光值的變化），每克籽粒每分鐘吸光值上升0.001定義為一個(gè)酶活單位（單位AU，absorbance unit）。PPO的活性表示為ΔA×103AU/（min·g）。

1.2.2.2 萌發(fā)期籽粒PPO活性檢測(cè) 在比色皿中依次加入2.8 mL磷酸緩沖液，1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚。用移液管加入0.3 mL粗酶液，混勻，迅速放入37℃水浴鍋中，水浴5 min后測(cè)OD420。每克籽粒每分鐘吸光值上升0.001定義為一個(gè)酶活單位（單位 AU，absorbance unit）。PPO的活性表示為ΔA×103AU/（min·g）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel和SAS統(tǒng)計(jì)分析程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO活性變異方差分析

由表1可知，基因型與發(fā)育時(shí)期互作PPO活性變異的方差分析中，籽粒發(fā)育的不同階段PPO活性差異極顯著，不同基因型和基因型與發(fā)育時(shí)期互作PPO活性差異都不顯著。因此，基因型對(duì)籽粒發(fā)育過(guò)程中PPO活性不具有顯著影響，基因型與發(fā)育時(shí)期互作對(duì)PPO活性也不具有顯著影響，而籽粒發(fā)育的不同階段對(duì)PPO活性有顯著影響，且發(fā)育時(shí)期間的PPO活性差異遠(yuǎn)大于品種間的差異。這表明籽粒發(fā)育的不同時(shí)期是影響PPO活性的主要因素。

表1 基因型與發(fā)育時(shí)期互作PPO活性變異的方差分析

從不同品種與萌發(fā)期互作PPO活性變異方差分析（表2）可看出，品種間PPO活性差異極顯著，不同萌發(fā)階段PPO活性差異也達(dá)到極顯著水平，而品種與萌發(fā)期互作PPO活性差異不顯著。這表明在小麥籽粒萌發(fā)過(guò)程中，品種和萌發(fā)期對(duì)PPO活性都有顯著影響。

表2 基因型與萌發(fā)期互作PPO活性變異方差分析

2.2 PPO活性的變化

圖1結(jié)果表明，籽粒發(fā)育過(guò)程PPO活性變化大致趨勢(shì)是先降低后升高，但品種間變化幅度不同。安農(nóng)95083-6-1和安農(nóng)0309 2個(gè)品種開始時(shí)PPO活性較高然后大幅度下降，下降后又漸漸升高；安農(nóng)95081-8、安農(nóng)9267、煙農(nóng)19和鄭麥9023這4個(gè)品種PPO活性的變化趨勢(shì)較為平緩。

由圖2可知，各品種PPO活性的變化趨勢(shì)和幅度不盡相同，宿麥553變化幅度較小，其余6個(gè)品種變化幅度較大；徐麥856 PPO活性變化呈先升高后降低的趨勢(shì)；連麥2號(hào)、邯鄲6172、皖麥52 3個(gè)品種PPO活性呈升高后降低接著再升高又降低的變化。這說(shuō)明小麥籽粒萌發(fā)過(guò)程中PPO活性是不穩(wěn)定的，但小麥籽粒萌發(fā)過(guò)程中成熟干籽粒（0 h）PPO活性最低。

3 結(jié)論與討論

小麥籽粒發(fā)育及萌發(fā)過(guò)程中PPO活性呈動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，存在著極其復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。通過(guò)對(duì)不同品種PPO活性的研究，不同發(fā)育期間的PPO活性差異遠(yuǎn)大于品種間的差異，籽粒發(fā)育過(guò)程中不同品種的不同發(fā)育時(shí)期間PPO活性變異水平不同，其PPO活性變化是開始時(shí)較高然后降低接著又升高，不同品種間這種變化幅度不同，一些品種變化幅度較大；萌發(fā)過(guò)程中PPO活性也是不穩(wěn)定的，各品種PPO活性的變化趨勢(shì)和幅度不盡相同，在小麥籽粒萌發(fā)過(guò)程中品種和萌發(fā)期對(duì)PPO活性都有顯著影響?，F(xiàn)已知道PPO是一種質(zhì)體酶，存在于葉綠體、白色體等質(zhì)體中，生理狀態(tài)下與底物嚴(yán)格隔離[10]，但在小麥籽粒萌發(fā)過(guò)程中，PPO易于釋放進(jìn)而與底物接觸，這可能會(huì)導(dǎo)致萌發(fā)過(guò)程PPO活性較高。

一些研究發(fā)現(xiàn)，在植物組織或器官中，幼嫩部位的PPO活性較高，而成熟或衰老部位的PPO活性低，但PPO的生理功能還不清楚[11，12]。由于PPO主要位于正常細(xì)胞的質(zhì)體中，其作為氧化還原酶被認(rèn)為與呼吸鏈末端電子傳遞有關(guān)，能消除氧自由基的傷害與催化植物或動(dòng)物的色素形成[13，14]。小麥植株P(guān)PO活性因感染病蟲而升高，因此PPO可能與植物自身防御功能有關(guān)，但缺乏直接的證據(jù)。此外，PPO與植物的生長(zhǎng)發(fā)育可能有關(guān)，可促進(jìn)乙烯的代謝。因此，本研究所得結(jié)果的原因可能有2個(gè)方面：一是籽粒本身抗性的需要，二是不同品種的小麥表達(dá)PPO的水平不同。

大量研究表明，PPO與植物抗病性密切相關(guān)，PPO活性升高是小麥抵抗病原侵入和擴(kuò)展的一種保護(hù)反應(yīng)。然而面制食品需要的是低PPO活性的小麥，以減輕面制食品的褐變，因而，在選育品種時(shí)，應(yīng)選擇籽粒發(fā)育期PPO活性高成熟后PPO活性低的品種。至于小麥籽粒發(fā)育和萌發(fā)期PPO活性變化是否存在內(nèi)在關(guān)系，這還有待于進(jìn)一步研究。但本研究得出的籽粒發(fā)育的不同時(shí)期是影響PPO活性的主要因素，籽粒萌發(fā)過(guò)程中品種和萌發(fā)期對(duì)PPO活性都有顯著影響，這一結(jié)論可為小麥品質(zhì)改良提供重要信息。

［1］ Baik BK，Czuchajowska Z，Pomeranz Y.Discoloration of dough for oriental noodles[J].Cereal Chemistry，1995，72：198-205.

［2］ Bhattacharya M，Luo Q，Corke H.Time-dependent changes in dough color in hexaploid wheat landraces differingin polyphenol oxidase activity[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（9）：3579-3585.

［3］ Feillet P，Autran J C，Verniere C L.Pasta brownness:an assessment[J].Journal of Cereal Science，2000，32：215-233.

［4］ Hatcher DW，Kruger JE.Distribution of polyphenoloxidases in flour mill streams of Canadian common wheat classes milled to threeextraction rates[J].Cereal Chemistry，1993，70：51.

［5］ Lamkin WM，Miller BS，Nelson SW，et al.Polyphenol oxidase activities of hard red winter，soft red winter，hard red spring，white common，club and durum wheat cultivars [J].Cereal Chemistry，1981，58（1）：27-31.

［6］ Kruger JE.Changesin thepolyphenol oxidases of wheat during kernel growth and maturation[J].Cereal Chem,1976，53（2）：201-213.

［7］ Taneja SR，Abrol Y P，Sachar RC.Modulation of o-diphenolase and monophenolase enzymes during wheat grain development[J].Cereal Chemistry，1974，51（2）：457-465.

［8］ Anderson JV，Morris CF.An improved whole-seed assay for screening wheat germplasm for polyphenol oxidase activity[J].Crop Science，2001，41：1697-1705.

［9］ Morris CF，Anderson JV.Distribution of PPOactivity amonga large number of hexaploid wheat genotypes using an improved L-DOPA assay[J].Cereal Foods World，1998，43：518-520.

［10］ W J，Shelton D R，Martin T J，et al.Variation in polyphenol Oxidase Activite and Quality Characteristic Among Hard White and Hard Winter Wheat Sample[J].Cereal Chem，1997，74（1）：7-11.

［11］ 金善寶.中國(guó)小麥學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996.

［12］ 蓋均益.作物栽培學(xué) [M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1994：98-123.

［13］ 薛俊杰，王永琳，張淑改，等.泡桐叢枝病過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶的研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，28（1）：62-64.

［14］ 云興福，崔世茂，霍秀文.黃瓜組織中幾種酶活性與其對(duì)雙霉病抗性的關(guān)系[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1995，10（1）：92-98.