李廷利，許光輝，徐瑞鑫

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

研究報(bào)告

影響野生型Canton S果蠅睡眠時(shí)間的相關(guān)生理因素

李廷利，許光輝，徐瑞鑫

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

目的探討影響果蠅睡眠時(shí)間的相關(guān)生理因素。方法選擇野生型Canton S果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(DAMS)，以5 min為單位自動(dòng)統(tǒng)計(jì)一次果蠅活動(dòng)次數(shù)，若5 m in內(nèi)活動(dòng)次數(shù)為零，認(rèn)為果蠅處于睡眠狀態(tài)，計(jì)為果蠅的睡眠時(shí)間，累積計(jì)算果蠅24 h睡眠總時(shí)間為指標(biāo)，分別觀察了日齡(7日齡)相同，而性別不同和性別(雌性)相同，而日齡(2，7，12，17，22，27和32日齡)不同果蠅的24 h睡眠總時(shí)間。結(jié)果①同一日齡(7日齡)不同性別的果蠅之間白天(12 h)及夜間(12 h)平均睡眠時(shí)間的長(zhǎng)短存在著顯著差異。雌果蠅白天(12 h)平均睡眠時(shí)間短于雄果蠅，而夜間(12 h)平均睡眠時(shí)間長(zhǎng)于雄果蠅。雌果蠅白天(12 h)平均睡眠時(shí)間顯著短于夜間平均睡眠時(shí)間(P＜0.05);而雄果蠅白天(12 h)平均睡眠時(shí)間與夜間(12 h)平均睡眠時(shí)間基本持平。②同一性別(雌性)不同日齡的果蠅，隨著日齡的增加，其白天(12 h)平均睡眠時(shí)間有逐漸縮短的趨勢(shì)，27日齡的果蠅睡眠時(shí)間減少相對(duì)明顯，32日齡果蠅的睡眠時(shí)間有所恢復(fù)，相互之間存在著顯著差異(P＜0.05)。夜間(12 h)平均睡眠時(shí)間有逐漸延長(zhǎng)的趨勢(shì)，27日齡果蠅的夜間平均睡眠時(shí)間有所減少，32日齡果蠅的夜間平均睡眠時(shí)間相對(duì)有所恢復(fù)，相互之間存在著顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論性別與日齡等生理因素對(duì)果蠅24 h睡眠時(shí)間有顯著的影響。

果蠅;睡眠時(shí)間;睡眠節(jié)律;果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)儀

果蠅具有清晰的遺傳背景;簡(jiǎn)約的神經(jīng)系統(tǒng);較短的生命周期;較強(qiáng)的繁殖能力;豐富的行為菜單和方便的基因操作等生物學(xué)特性，以往其作為一個(gè)經(jīng)典的模式生物在遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。近十年來(lái)，大量研究結(jié)果表明，果蠅具有哺乳動(dòng)物共有的睡眠生物特征［1］，將其作為模式生物應(yīng)用于睡眠及睡眠發(fā)生機(jī)制的研究［2－4］。

為了利用果蠅這一模式生物開(kāi)展睡眠有關(guān)方面的研究，我們對(duì)影響果蠅睡眠時(shí)間的相關(guān)生理因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:野生型Canton S品系黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 果蠅培養(yǎng)基:蒸餾水460 g，玉米粉42 g，蔗糖31 g，瓊脂3 g，酵母粉3 g，丙酸3 m L。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:果蠅群體活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(DAMS，美國(guó)Trikinetics公司)，該系統(tǒng)由果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)器與數(shù)據(jù)采集分析軟件組成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境:溫度:(24±1)℃;濕度:50%～60%;光照:12 h自動(dòng)亮－暗循環(huán)(7:00開(kāi)燈，19:00關(guān)燈)。

1.2.2 果蠅睡眠監(jiān)測(cè)方法:將實(shí)驗(yàn)果蠅轉(zhuǎn)入細(xì)小玻璃管(內(nèi)徑5 mm，長(zhǎng)6.5 cm，一端內(nèi)裝有果蠅的培養(yǎng)基并用石蠟或黑色小帽封住，另一端用棉球封住)內(nèi)，每只小管裝一只果蠅。然后將細(xì)小玻璃管嵌入到果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)器上。一個(gè)監(jiān)測(cè)器可同時(shí)監(jiān)測(cè)32只果蠅，監(jiān)測(cè)器直接連在計(jì)算機(jī)上，監(jiān)測(cè)器發(fā)出紅外光束橫穿細(xì)小玻璃管中部，果蠅每次從玻璃管中部經(jīng)過(guò)時(shí)阻斷紅外光束，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄1次，DAM系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集軟件每隔5 min自動(dòng)記錄一次果蠅活動(dòng)次數(shù)。若持續(xù)5 min以上活動(dòng)次數(shù)記錄為零，即果蠅靜止時(shí)間持續(xù)5 min以上時(shí)，此休息狀態(tài)符合睡眠行為標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為果蠅處于睡眠狀態(tài)［5］。在實(shí)驗(yàn)12 h前，將果蠅裝入小管內(nèi)適應(yīng)環(huán)境。

1.2.3 性別對(duì)果蠅睡眠時(shí)間的影響:收集12 h內(nèi)羽化的果蠅，雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)，隨機(jī)分布選擇7日齡的雌雄果蠅32只，移入到果蠅睡眠監(jiān)測(cè)管(于監(jiān)測(cè)前適應(yīng)12 h)中，對(duì)雌雄果蠅分別進(jìn)行活動(dòng)監(jiān)測(cè)，按上述果蠅睡眠判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算其總睡眠時(shí)間。同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 日齡對(duì)雌果蠅睡眠時(shí)間的影響:收集12h內(nèi)羽化的果蠅，雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)，隨機(jī)分別選擇2、7、12、17、22、27日齡和32日齡的雌果蠅各32只，移入果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)管(于監(jiān)測(cè)前適應(yīng)12 h)中，對(duì)不同日齡的果蠅分別進(jìn)行活動(dòng)監(jiān)測(cè)，計(jì)算其睡眠總時(shí)間。同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析:通過(guò)EXCEL軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以實(shí)驗(yàn)果蠅每小時(shí)睡眠時(shí)間(單位:分鐘/小時(shí))的平均值為縱坐標(biāo)繪圖。采用SPSS13.0分析軟件，不同類型的數(shù)據(jù)先通過(guò)正態(tài)分布檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，進(jìn)行LSD法分析。

2 結(jié)果

2.1 性別對(duì)果蠅睡眠時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。

圖1 7日齡果蠅睡眠節(jié)律變化Fig.1 The changes of sleep and awake in 7－day－old drosophila

表1 7日齡雌、雄果蠅平均睡眠時(shí)間比較(±s，min/h)Tab.1 Comparison of the average sleep time between 7－day－old male and female dosophila(±s，min/h)

表1 7日齡雌、雄果蠅平均睡眠時(shí)間比較(±s，min/h)Tab.1 Comparison of the average sleep time between 7－day－old male and female dosophila(±s，min/h)

注:同日齡(7日齡)的雌、雄果蠅在白天和夜晚的平均睡眠時(shí)間相比較，*為P＜0.05;同日齡(7日齡)的雌和雄果蠅在白天或夜晚的平均睡眠時(shí)間相比較，△△為P＜0.01。*Represents P＜0.05，comparison of the average sleep time between 7－dayold male and female dosophila;△△represents P＜0.01，comparison of the average sleep time of day and night in 7－day－old male or female dosophila.

性別Gender白天平均睡眠時(shí)間Average sleep time of day夜晚平均睡眠時(shí)間Average sleep time of night雌Female 14.4±11.7*△△42.6±15.3雄Male 36.1±20.6 38.5±17.0

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一日齡(7日齡)不同性別的果蠅之間白天(12 h)平均睡眠時(shí)間的長(zhǎng)短存在著顯著差異。雌果蠅白天(12 h)平均睡眠時(shí)間短于雄果蠅(P＜0.01)。雌果蠅白天(12 h)平均睡眠時(shí)間顯著短于夜間平均睡眠時(shí)間(P＜0.05);而雄果蠅白天(12 h)平均睡眠時(shí)間與夜間(12 h)平均睡眠時(shí)間基本持平。

2.2 日齡對(duì)雌果蠅睡眠時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2(彩插4)、圖3和表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:同一性別(雌性)不同日齡的果蠅，隨著日齡的增加，其白天(12 h)平均睡眠時(shí)間有逐漸縮短的趨勢(shì)，27日齡的果蠅睡眠時(shí)間減少相對(duì)明顯，32日齡果蠅的睡眠時(shí)間有所恢復(fù)，相互之間存在著顯著差異(P＜0.05)。夜間(12 h)平均睡眠時(shí)間有逐漸延長(zhǎng)的趨勢(shì)，27日齡果蠅的夜間平均睡眠時(shí)間有所減少(P＜0.05)，32日齡果蠅的夜間平均睡眠時(shí)間相對(duì)有所恢復(fù)。

圖3 不同日齡雌果蠅平均睡眠時(shí)間Fig.3 The average sleep time during the day and night with age in female drosophila

表2 不同日齡雌果蠅睡眠時(shí)間的變化(±s，min/h)Tab.2 The changes of sleep time in female drosophila of different ages(±s，min/h)

表2 不同日齡雌果蠅睡眠時(shí)間的變化(±s，min/h)Tab.2 The changes of sleep time in female drosophila of different ages(±s，min/h)

注:不同日齡果蠅與7日齡果蠅的白天(12 h)或夜間(12 h)平均睡眠時(shí)間相比較(LSD檢驗(yàn))，*為P＜0.05.*Represents P＜0.05 vs.7－day－old drosophila(One－way ANOVA，LSD test).

日齡Day白天平均睡眠時(shí)間Average sleep time during the day夜晚平均睡眠時(shí)間Average sleep time during the night 2 21.4±9.1*39.1±9.4 7 14.4±11.7 42.6±15.3 12 18.4±11.3 47.3±8.9 17 15.6±13.6 45.4±10.9 22 13.2±4.5 46.1±10.0 27 8.7±3.2 31.1±9.2*32 12.8±2.4 35.8±6.1

3 討論

睡眠是一個(gè)基本的生物學(xué)過(guò)程，涉及有機(jī)體的功能和對(duì)不斷變化的外界環(huán)境的反應(yīng)。

果蠅作為睡眠研究的模式生物關(guān)鍵在于它是否具有真正意義上的睡眠。在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類，睡眠的判定是直觀的，通過(guò)腦電、肌電、眼電等電生理現(xiàn)象可以區(qū)分其清醒和睡眠兩種狀態(tài)。然而對(duì)于無(wú)脊椎動(dòng)物，由于缺乏產(chǎn)生腦電的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，所以只能通過(guò)行為標(biāo)準(zhǔn)去界定它們是否存在睡眠狀態(tài)。

目前界定睡眠的行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)［2，6］:靜止時(shí)間的延長(zhǎng);具有特定的姿勢(shì)和休息的位置;激醒反應(yīng)閾的提高;在外界刺激下可快速可逆;具有內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)——睡眠剝奪后對(duì)睡眠需求的增加［7］;具有晝夜節(jié)律性。用這些標(biāo)準(zhǔn)研究果蠅發(fā)現(xiàn)，果蠅在它類似睡眠的休息狀態(tài)下，表現(xiàn)出對(duì)輕微的刺激沒(méi)有反應(yīng)。它們?cè)谛袨閷W(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出活動(dòng)減少和喚醒閾值提高，大多數(shù)果蠅距離食物1 mm、背對(duì)著食物的方向靜止不動(dòng)，僅腹部有一定的呼吸，散在鼻動(dòng)或是極少數(shù)出現(xiàn)四肢震顫和抽搐，果蠅每天都保持這種睡眠狀態(tài)很長(zhǎng)時(shí)間［8］，并且主要的休息時(shí)間發(fā)生在黑夜的前半夜。但是在較大的刺激下，可以被喚醒。當(dāng)睡眠被剝奪(手動(dòng)或自動(dòng))后，果蠅會(huì)代償性增加睡眠時(shí)間，第二天它們表現(xiàn)出休息需要的增加和一個(gè)明顯的代償式休息延長(zhǎng)，表現(xiàn)出內(nèi)穩(wěn)定調(diào)節(jié)。如同哺乳動(dòng)物一樣睡眠回跳發(fā)生在睡眠剝奪結(jié)束時(shí)，相對(duì)于短時(shí)剝奪(6 h)，長(zhǎng)時(shí)剝奪(12～24 h)更為顯著，恢復(fù)的睡眠僅僅是它被剝奪時(shí)間的一個(gè)片段［9］。這種自我平衡穩(wěn)態(tài)的睡眠行為反彈與睡眠損失有關(guān)，與刺激的停止無(wú)關(guān)。

隨著果蠅活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用，果蠅的睡眠狀態(tài)得以監(jiān)測(cè)、睡眠時(shí)間得以量化。早期應(yīng)用超聲活動(dòng)監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行果蠅睡眠行為的監(jiān)測(cè)，但是這種方法只能對(duì)一只果蠅進(jìn)行連續(xù)的、高分辨率的監(jiān)測(cè)。目前普遍采用自動(dòng)紅外監(jiān)測(cè)儀(DAMS)來(lái)監(jiān)測(cè)果蠅的睡眠行為和計(jì)算果蠅的睡眠時(shí)間，其可以同時(shí)監(jiān)測(cè)多只果蠅的睡眠時(shí)間。DAMS監(jiān)測(cè)系統(tǒng)包括監(jiān)測(cè)器和數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)。

經(jīng)過(guò)大量研究，得出了一致結(jié)論:果蠅靜止時(shí)間持續(xù)5 min以上，此狀態(tài)符合睡眠行為標(biāo)準(zhǔn)。因此，利用DAMS監(jiān)測(cè)，果蠅靜止不動(dòng)長(zhǎng)于5 m in時(shí)，被定義為果蠅處于睡眠狀態(tài)［3，10］，并以此計(jì)算其24 h的總睡眠時(shí)間。

本研究以野生型Canton S果蠅為觀察對(duì)象，利用DAMS系統(tǒng)，觀察了性別與日齡對(duì)果蠅睡眠時(shí)間的影響，研究結(jié)果提示我們，在今后利用果蠅這一模式生物開(kāi)展睡眠研究時(shí)，要充分考慮到相關(guān)生理因素對(duì)果蠅睡眠時(shí)間的影響。

(本文圖2見(jiàn)彩插4。)

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Effects of Gender and Age in Days on the Sleep Rhythm of Drosophila melanogasters

LI Ting－li，XU Guang－h(huán)ui，XU Rui－xin
(Pharmaceutical College，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Haerbin 150040，China) Corresponding author:LI Ting－li

ObjectiveTo exp lore the physiological factors affecting the sleep duration of Drosophila melanogaster.M ethods Canton－S wild type Drosophila was chosen as the experimental object，and the sleep duration of Drosophila was determined by an infrared activity monitoring system(DAMS).Sleep was defined as any period of uninterrupted behavioral immobility lasting longer than 5 minutes.All the immobility time was counted together as the sleep duration during 24 hr.Drosophila of the same age(7－day old)and different genders，as well as of the same gender (female)and different ages(2，7，12，17，22，27 and 32－day old)were observed during a 24 hr－day to make a comparison of their sleep duration.Results①There was a significant difference between 7－day old males and females，either in day－time(12 hr)or in the night－time(12 hr).Female drosophila had a shorter sleep duration in day－time(12 hr)than that of males，while it was longer than that of males in night－time(12 hr).On the other hand，the females slept significantly less in day－time(12 hr)than in night－time(12 hr)(P＜0.05)compared with the males.②A long with the increasing of age，the sleep duration became much longer in female drosophila.But there was a tendency that sleep period during day－time becoming shorter，especially in 27－day－old drosophila.When the age reached up to 32 days，the sleep period was relatively recovered.All those changes had a significant difference(P＜0.05)between each other.Similarly，27－day－old drosophila had a less sleep duration in night－time which was recovered to a certain extent in 32－day drosophila，while the average sleep period in night－time was somehow increasing.We also derive significant difference(P＜0.05)inthese discrepancy.ConlusionGender and age and other physiological factors significantly affect the sleep time of flies during 24 hr.

Drosophila melanogaster;Sleep time;Sleep rhythm;DAMS

Q－331

A

1005－4847(2010)02－0105－04

2009－09－28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào):30672634)。

李廷利，教授，男，漢族，黑龍江哈爾濱人，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物及復(fù)方生物活性的研究。Email: litingli8888@sohu.com