費(fèi) 瑜,劉賢英,李桂榮,才 華,費(fèi) 瑞

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春130041; 2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130021)

水溶性殼聚糖對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

費(fèi) 瑜1,劉賢英1,李桂榮1,才 華2,費(fèi) 瑞2

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春130041; 2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130021)

通過(guò)化學(xué)方法測(cè)定了水溶性殼聚糖(water-solubility chitosan,WSC)的部分理化性質(zhì);通過(guò)原代分離培養(yǎng)大鼠腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和MTT實(shí)驗(yàn),研究了1,10,100和1000μg/mL的WSC對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,WSC溶解度為125,含水量13.19%,脫乙酰度54.73%,重均相對(duì)分子質(zhì)量1.17×105.在24 h和48 h時(shí),大于10μg/mL的WSC可抑制原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖.其中,100和1000μg/mL的WSC在48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖的抑制作用最明顯,表明在一定條件下,WSC可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖,減輕由血管平滑肌細(xì)胞增殖所引起的血管狹窄問(wèn)題.

水溶性殼聚糖;血管平滑肌細(xì)胞;增值

0 引言

血管狹窄(restenosis,RS)是血管創(chuàng)傷愈合的系統(tǒng)反應(yīng),涉及血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、炎癥細(xì)胞和血液蛋白之間的復(fù)雜作用.其中,VSMCs的遷移和增殖是導(dǎo)致血管狹窄的重要環(huán)節(jié)[1-2].Clowes等研究發(fā)現(xiàn),在大鼠頸動(dòng)脈模型中,血管中層的VSMCs在損傷后幾小時(shí)內(nèi)即開(kāi)始增殖,第4天遷移至內(nèi)膜;14～21 d VSMCs數(shù)目增加為原來(lái)的3～5倍,占最終內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)目的90%[3].近年來(lái),應(yīng)用藥物防治血管狹窄問(wèn)題逐漸受到重視[4].一些抗血栓形成藥物、血管擴(kuò)張劑、抗增生藥物及降血脂藥物等,盡管能選擇性地抑制某一活性因子,使血管狹窄得到緩解,但并沒(méi)有使再狹窄的發(fā)生得到控制[5].因此,開(kāi)發(fā)一種安全有效的抑制VSMCs增殖的藥物,對(duì)降低冠心病經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention,PCI)治療后血管狹窄的發(fā)生具有十分重要的臨床意義.

水溶性殼聚糖(water-solubility chitosan,WSC)是殼聚糖的降解產(chǎn)物,它除具備殼聚糖原有的特點(diǎn)外,還具有易溶于水和利于吸收利用等特點(diǎn),因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用前景[6].Kosuzuki等實(shí)驗(yàn)證明,殼聚糖及其衍生物可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7];劉曉宇等研究發(fā)現(xiàn),兩性殼聚糖在體內(nèi)對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖有顯著的刺激活性,但在體外對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖無(wú)影響[8].一些研究還顯示,低分子殼聚糖(low molecular weight chitosan,LMWC)具有結(jié)合膽酸、降低膽固醇、升高 HDL-C/TC的作用,表明LWMC可用于血管狹窄的防治[9].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外原代培養(yǎng)大鼠腹主動(dòng)脈VSMCs,探討了WSC對(duì)VSMCs增殖的影響,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)抑制血管狹窄的藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

WSC(青島海普);膠原酶Ⅱ(Invitrogen);四唑鹽(Genview);二甲基亞砜(Sigma).

1.2 設(shè)備

顯微鏡(日本,OLYMPUS);酶標(biāo)儀(Austria,T ecan A-5082);高效液相色譜儀(日本,SHIMADZU).

1.3 動(dòng)物

體重(150±10)g SD大鼠(SPF),由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):吉實(shí)動(dòng)質(zhì)(2000)-042號(hào).實(shí)驗(yàn)前在室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)2 d.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 WSC溶解度測(cè)定

室溫下精確量取100 mL蒸餾水注入錐形瓶,同時(shí)準(zhǔn)確稱(chēng)取WSC并逐漸加入錐形瓶,直至液體變?yōu)槟z狀.三次重復(fù),取平均值.利用下列公式計(jì)算WSC溶解度:

式中,G1為原有的WSC質(zhì)量(g),G2為剩余的WSC質(zhì)量(g).

1.4.2 WSC含水量測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的WSC,在25℃恒溫干燥箱中烘干至恒重.三次重復(fù),取平均值.利用下列公式計(jì)算含水量:

式中,G1和G2分別為烘干前后的糖樣品質(zhì)量(g).

1.4.3 WSC脫乙酰度測(cè)定

將WSC樣品放于干燥箱中,25℃烘干至恒重.準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3 g樣品置于250 mL錐形瓶中;先加入標(biāo)準(zhǔn)0.1 mol/L鹽酸溶液30 mL,室溫(20℃～25℃)下溶解完全;再加入5 mL混合指示劑(V(1%甲基橙)∶V(1%苯胺藍(lán))=1∶2).用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至錐形瓶中溶液剛好變色,即為滴定終點(diǎn).重復(fù)三次,取平均值,按下列公式計(jì)算脫乙酰度:

式中,G1為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);C2為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);V1為加入的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);V2為滴定的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);G為樣品質(zhì)量(g).

1.4.4 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定.儀器:SHIMADZU LC-l0Atm(Japan);監(jiān)測(cè)器:SHIMADZU RID-10A;工作站:CLASS VP;色譜柱:TSK-GEL,G-4000 PWXL,7.8(ID)×30.0 cm(L);流動(dòng)相: 0.9%NaCl;流速:0.5 mL/min;柱溫:40℃;壓力:1.6 MPa;進(jìn)樣量:20μL.

1.4.5 大鼠腹主動(dòng)脈VSMCs的提取和培養(yǎng)

處死大鼠,分離胸腹主動(dòng)脈,D-Hanks液漂洗2～3次.剪去血管外脂肪及結(jié)締組織,剖開(kāi)血管,刮去內(nèi)膜細(xì)胞.將動(dòng)脈置于含10%FBS的DMEM中,37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h;取出剪碎,放入2 g/L膠原酶后,繼續(xù)孵育12 h.取出,離心收集細(xì)胞,加入含20%FBS的DMEM,放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).2～3 d后更換新鮮培養(yǎng)液;5 d左右,細(xì)胞融合達(dá)到70%～80%時(shí),進(jìn)行傳代和純化.

1.4.6 大鼠腹主動(dòng)脈VSMCs的純化

取一細(xì)胞生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)瓶,加入少量0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液.然后,將細(xì)胞懸液移入新培養(yǎng)瓶中靜置15 min,收集培養(yǎng)液并放入另一培養(yǎng)瓶,再次靜置15 min.重復(fù)上述步驟2次,離心.加入新鮮含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).α-actin標(biāo)記為陽(yáng)性用于實(shí)驗(yàn)研究.

1.4.7 WSC對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈VSMCs增殖的影響

采用MTT比色法測(cè)定VSMCs的增殖結(jié)果.取6代以?xún)?nèi)細(xì)胞,加無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,進(jìn)行血清饑餓同步化處理.然后,用0.25%胰蛋白酶消化,制成細(xì)胞懸液,以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于3塊96孔板,即每孔接種細(xì)胞懸液200μL.將細(xì)胞分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組6個(gè)復(fù)孔.對(duì)照組加入含10%FBS的DMEM;實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度(1,10,100和1000μg/mL)的WSC,每孔50μL,分別作用24,48和 72 h.在培養(yǎng)結(jié)束前4 h,吸去培養(yǎng)液,每孔加入新配置的 0.4%的 MTT溶液100μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h.小心吸去培養(yǎng)液,加入150μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,然后迅速用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)量各孔吸光值D(492).

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.統(tǒng)計(jì)的差異顯著性由ANOVA(方差)檢驗(yàn).概率值P<0.05為統(tǒng)計(jì)的顯著性,P<0.01為統(tǒng)計(jì)的極顯著性.

2 結(jié)果

2.1 WSC溶解度測(cè)定結(jié)果

室溫下WSC的溶解度為125.溶解過(guò)程中,WSC呈棕褐色,遇水即溶,表明WSC有良好的水溶性.

2.2 WSC含水量測(cè)定結(jié)果

如表1所示,WSC的含水量為13.19%,表明該糖為較干燥的樣品.

表1 WSC含水量測(cè)定

2.3 WSC脫乙酰度測(cè)定結(jié)果

用標(biāo)準(zhǔn)0.1 mol/L NaOH溶液滴定WSC的終點(diǎn)是測(cè)試液變成橙黃色.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,WSC的脫乙酰度為54.73%.

表2 WSC脫乙酰度測(cè)定

2.4 WSC相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

如圖1所示,經(jīng)HPLC法測(cè)定,WSC重均相對(duì)分子質(zhì)量約為1.17×105.WSC有3個(gè)主要的峰,出峰時(shí)間分別為:11.906,13.657和15.357 min,所占峰面積分別為47.39%,16.81%,12.97%,說(shuō)明樣品的相對(duì)分子質(zhì)量主要由這3種多糖組分決定.另外,由圖1可見(jiàn):第一個(gè)峰所占面積遠(yuǎn)大于其他各峰,說(shuō)明樣品中此相對(duì)分子質(zhì)量的多糖含量最高.

圖1 WSC的HPLC分析

2.5 WSC對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的影響

MTT測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)表3)表明:作用24 h時(shí),隨濃度增大,WSC對(duì)細(xì)胞的抑制作用加大.當(dāng)質(zhì)量濃度大于10μg/mL時(shí),WSC對(duì)細(xì)胞的抑制作用與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05).作用48 h時(shí), WSC對(duì)細(xì)胞的抑制作用呈明顯濃度依賴(lài)性,其中,質(zhì)量濃度大于100μg/mL時(shí),WSC對(duì)細(xì)胞的抑制作用與對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01).作用72 h后,細(xì)胞增殖能力減弱,各組細(xì)胞生長(zhǎng)變化差異不明顯(P>0.05).

表3 WSC對(duì)平滑肌細(xì)胞的增殖作用

3 討論

許多研究證實(shí),化學(xué)改性劑、衍生物及溶劑等都影響殼聚糖的基本性能,從而使其生理功能發(fā)生變化[10-11].WSC是殼聚糖的降解產(chǎn)物,因此對(duì)WSC理化性質(zhì)的研究有利于全面了解該成分的活性.脫乙酰度表征了乙?；c脫乙?；g的平衡程度,說(shuō)明了殼聚糖中自由氨基的含量,脫乙酰度大小直接影響到殼聚糖的結(jié)晶性、溶解性及一些重要的生理活性等.實(shí)驗(yàn)證明,脫乙酰度越高、相對(duì)分子質(zhì)量越小,越易溶于水,其中,脫乙酰度在45%～55%之間的殼聚糖水溶性較好[12].本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的WSC的脫乙酰度為54.73%,其溶解度(125)與上述結(jié)論相吻合.為進(jìn)一步搞清WSC的理化性質(zhì),我們又對(duì)其含水量和相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行了測(cè)定.實(shí)驗(yàn)測(cè)得,WSC的含水量為13.19%,重均相對(duì)分子質(zhì)量是1.17×105.

研究表明,殼聚糖及其衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的抑制作用;而LMTC也可通過(guò)干擾細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu),阻止生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜上受體的結(jié)合,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制[13-14].實(shí)驗(yàn)證明,大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷后,VSMCs大量增殖,約占整個(gè)新生內(nèi)膜細(xì)胞總數(shù)的88.8%[15].因此,本實(shí)驗(yàn)根據(jù)以往文獻(xiàn),分離了大鼠腹主動(dòng)脈VSMCs,研究了WSC對(duì)該VSMCs生長(zhǎng)的抑制作用.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在48 h以?xún)?nèi), WSC均能在一定范圍內(nèi)抑制大鼠腹主動(dòng)脈VSMCs的增殖,其中,WSC在100,1000μg/mL時(shí)顯現(xiàn)出最好的抑制效果.分析原因很可能與WSC的較強(qiáng)水溶性有關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí).另外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí),細(xì)胞增殖能力減弱,WSC的作用不明顯.分析原因可能與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān).因?yàn)樵囵B(yǎng)的細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)、生存空間等條件要求較高,細(xì)胞的大量增殖使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境惡化,導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡,細(xì)胞增殖能力降低,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[16].

我們的實(shí)驗(yàn)證明,WSC在一定條件下對(duì)VSMCs的增殖有明顯的抑制作用,可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成治療血管再狹窄的高效、低不良反應(yīng)藥物.

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(責(zé)任編輯:方 林)

Effect of water-soluble chitosan on the proliferation of vaseular smooth muscle cells

FEI Yu1,LIU Xian-ying1,LI Gui-rong1,CAI Hua2,FEI Rui2

(1.Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 2.School of Norman Bethune Medical Science,Jilin University,Changchun 130021,China)

To assay the physical and chemical properties of water-soluble chitosans(WSC)by chemical method,and to research the effect of WSC,in the concentration of 1,10,100 and 1000μg/mL,on proliferation of vascular smooth muscle cells by the separating big the aorta smooth muscle cells of rats and MTT experiment.Results show that WSC solubility,moisture content and deacelation degree were respectively 125,13.19%and 54.73%,molecular weight was 1.17×105.WSC of more than 10μg/mL concentration of 24 h or 48 h,could inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells.Especially when in the concentration of 100μg/mL and 1000μg/mL of 48 h,WSC could obvious inhibit cells proliferation.These results showed that under certain conditions,WSC can inhibit vascular smooth muscle cells proliferation,reduce restenosis caused by vascular smooth muscle cells.

water-soluble chitosans;vascular smooth muscle cells;proliferation

Q 946.3[學(xué)科代碼]180·5120

A

1000-1832(2010)04-0121-05

2010-05-23

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(200705354).

費(fèi)瑜(1963—),男,博士研究生,主任醫(yī)師,主要從事心血管介入治療研究;通訊作者:費(fèi)瑞(1964—),男,博士,教授,主要從事多糖生物活性研究.