呂 健 詹懷宇 付時(shí)雨

(華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州,510640)

響應(yīng)面法優(yōu)化漂白漿酶水解

呂 健 詹懷宇 付時(shí)雨

(華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州,510640)

采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),研究了溫度、酶用量和pH值對漂白針葉木漿酶解效率的影響,分別提出了用于預(yù)測可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率的數(shù)學(xué)模型。通過規(guī)劃求解,優(yōu)化了3個(gè)因素:當(dāng)溫度、酶用量和pH值分別為52.8℃、10 g/L、5.5以及45.9℃、10 g/L、5.3時(shí),可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到最大81.5%和54.3%。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)測數(shù)據(jù)的對比,證明模型具有準(zhǔn)確的預(yù)測性能。

纖維素;漂白漿;酶水解;響應(yīng)面法

纖維素是自然界中儲(chǔ)量最大的可再生聚合物,年產(chǎn)量約為1011～1012t[1]。隨著化石能源的日益缺乏、生物質(zhì)能源的迅速發(fā)展,利用纖維素基原料,通過纖維素酶水解產(chǎn)生葡萄糖進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乙醇或能源氣的研究引起了人們的極大關(guān)注[2-3]。其中,纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的可溶糖和葡萄糖的效率是評價(jià)能否工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。

纖維素酶解是在一個(gè)由纖維素原料、纖維素酶和反應(yīng)器組成的復(fù)雜的固液體系中進(jìn)行的,因此影響纖維素酶水解的因素也非常復(fù)雜[4]。從纖維素原料性質(zhì)上來說包括纖維素的結(jié)晶度、聚合度、表面積等[5-7],從酶的性質(zhì)上包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的組成與活性[8-9]。從工業(yè)上來說,人們更關(guān)心工藝條件的影響,主要包括反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、底物濃度和酶用量等[10-11]。這些因素并不是單獨(dú)影響纖維素酶解效率的,因素間存在協(xié)同效應(yīng)。

為了研究工藝因素對纖維素酶解的影響以及協(xié)同效應(yīng),優(yōu)化纖維素酶解效率,本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法研究了溫度、酶用量和pH值對漂白針葉木漿酶解效率的影響。響應(yīng)面法是一種利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)知識(shí),通過數(shù)學(xué)建模和分析,評估多個(gè)自變量單獨(dú)和同時(shí)對因變量影響的方法,其主要目標(biāo)是利用模型優(yōu)化因變量的響應(yīng)[12-13]。響應(yīng)面曲線法的優(yōu)點(diǎn)在于能從最少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)中獲得最多的信息,其數(shù)學(xué)模型采用多元二次方程,形式如式(1)所示:

其中,Xi和Xj表示自變量,Y表示響應(yīng)變量, β0、βi、βii和βij為方程的系數(shù),βi、βii和βij分別代表因素的線性影響、平方影響和因素間的協(xié)同影響。在自然科學(xué)研究和工程研究中,該方法得到了廣泛的應(yīng)用[1415]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、原料及儀器

漂白針葉漿:取自國內(nèi)某廠。

纖維素酶:Pergalase7547(來源于Trichoder m a reesei),酶活力12.8 FPU/mL。

總有機(jī)碳測定儀(TOC-VCSH,SH IMADZU):日本島津公司生產(chǎn)。

離散式全自動(dòng)化學(xué)分析儀(DA3500):美國O.I.Analytical公司生產(chǎn);結(jié)合Megazyme公司生產(chǎn)的D-葡萄糖檢測試劑包,用于葡萄糖的定量測定。

緩沖溶液:根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件,配置pH值范圍為3～7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

將漂白針葉木漿分散于不同pH值、濃度0.5mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中,配制成質(zhì)量濃度10 g/L的纖維懸浮液。加熱至預(yù)定溫度并保持20 min,確保紙漿纖維分散均勻。然后在反應(yīng)器中加入纖維素酶,保持?jǐn)嚢杷俣?00 r/min,反應(yīng)進(jìn)行24 h后取樣,離心過濾后取濾液測定樣品中有機(jī)碳含量和葡萄糖含量。通過反應(yīng)前后的有機(jī)碳含量和葡萄糖含量計(jì)算纖維的可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率。可溶糖包括纖維素降解后溶解在水解液中的葡萄糖、纖維二糖和纖維多糖。

可溶糖轉(zhuǎn)化率Y1(%)計(jì)算公式為:

葡萄糖轉(zhuǎn)化率Y2(%)計(jì)算公式為:

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),主要研究反應(yīng)溫度(X1)、纖維素酶用量(X2)和pH值(X3)3個(gè)因素對纖維素酶解過程中可溶糖轉(zhuǎn)化率(Y1)和葡萄糖轉(zhuǎn)化率(Y2)的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和回歸分析均在Design Expert(7.1.5,Statease, Inc.,USA)軟件中運(yùn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果

影響纖維素酶水解的工藝因素主要有反應(yīng)溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、底物質(zhì)量濃度和酶用量等。初始進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn),研究了每個(gè)因素對纖維素酶解葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響,以確定各因素的取值范圍。

底物濃度的選擇與反應(yīng)器的形狀以及攪拌強(qiáng)度有關(guān),本實(shí)驗(yàn)以錐形瓶為反應(yīng)器,置于振蕩水浴中進(jìn)行。由于攪拌強(qiáng)度較弱,為了使反應(yīng)均一,底物質(zhì)量濃度不宜太高,本實(shí)驗(yàn)中選擇10 g/L。實(shí)驗(yàn)證明,在本實(shí)驗(yàn)條件下,底物濃度太高不利于紙漿纖維的酶解。紙漿纖維的酶解效率隨反應(yīng)時(shí)間增加不斷增加,只是反應(yīng)速率逐漸減小。單因素實(shí)驗(yàn)證明,反應(yīng)時(shí)間超過24 h后,酶解效率提高幅度已很低。因此,在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中再研究底物質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間兩個(gè)因素顯得意義不大。因此固定底物質(zhì)量濃度為10 g/L,反應(yīng)時(shí)間為24 h,在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中僅研究反應(yīng)溫度、酶用量和pH值的影響。

本實(shí)驗(yàn)使用的纖維素酶為工業(yè)用酶,其酶活較低(12.8 FPU/mL),實(shí)驗(yàn)中其用量取值范圍較高,為2～10 g/L。反應(yīng)溫度對纖維素酶解葡萄糖轉(zhuǎn)化率影響的單因素實(shí)驗(yàn)(酶用量6 g/L,pH值4.8)的結(jié)果表明(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略),本實(shí)驗(yàn)所選用的纖維素酶最適宜的反應(yīng)溫度在40～60℃之間,在該溫度范圍之外的葡萄糖轉(zhuǎn)化率明顯降低。pH值對纖維素酶解葡萄糖轉(zhuǎn)化率影響的單因素實(shí)驗(yàn)(反應(yīng)溫度50℃,酶用量6 g/L)結(jié)果表明(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略),在一個(gè)較寬的pH值范圍(3～7)內(nèi),葡萄糖轉(zhuǎn)化率較高,且區(qū)別并不大。

根據(jù)初始的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定下一步響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中反應(yīng)溫度的中心點(diǎn)為50℃,步長為10℃;酶用量的中心點(diǎn)為6 g/L,步長為4 g/L;pH值的中心點(diǎn)為5,步長為2。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的變量與取值如表1所示。

表1 漂白漿酶解變量的取值范圍

2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),考察3個(gè)自變量時(shí)需要17組實(shí)驗(yàn),如表2所示,這些實(shí)驗(yàn)是由3個(gè)因素不同組合起來得到的。

為了減少系統(tǒng)誤差,從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)次序中隨機(jī)抽取,進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)序號重排。所有的實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過3次測量,取平均值,并且保證相對偏差在5%以內(nèi)各組實(shí)驗(yàn)得到的可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率結(jié)果見表2。

從表2結(jié)果可知,通過改變溫度、酶用量和pH值,可溶糖轉(zhuǎn)化率在40%～80%間變化,葡萄糖轉(zhuǎn)化率在15%～55%間變化。不同的因素組合下,可溶糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)化率差異很大。反應(yīng)溫度從40℃提高到60℃,可溶糖轉(zhuǎn)化率提高,但是葡萄糖轉(zhuǎn)化率下降(標(biāo)準(zhǔn)序號1、2,標(biāo)準(zhǔn)序號3、4,標(biāo)準(zhǔn)序號5、6或者標(biāo)準(zhǔn)序號7、8);酶用量從2 g/L提高到10 g/L,可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率都顯著提高(標(biāo)準(zhǔn)序號1、3、標(biāo)準(zhǔn)序號2、4,標(biāo)準(zhǔn)序號9、10或者標(biāo)準(zhǔn)序號11、12);pH值從3提高到7,可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率有少許增加(標(biāo)準(zhǔn)序號5、7、標(biāo)準(zhǔn)序號6、8,標(biāo)準(zhǔn)序號9、11或者標(biāo)準(zhǔn)序號10、12)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 模型的擬合及方差分析

通過對表2中17組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的回歸分析,利用式(1)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,得到了表示可溶糖轉(zhuǎn)化率(Y1)和葡萄糖轉(zhuǎn)化率(Y2)的回歸方程,分別為:

式(4)和式(5)即為以溫度(40～60℃)、酶用量(2～10 g/L)和pH值(3～7)為自變量時(shí),可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率的預(yù)測模型。圖1和圖2分別為可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率的模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值的對應(yīng)關(guān)系,從圖1～圖2可見預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值吻合非常好。

為了說明以上兩個(gè)模型的有效性,利用Design Expert分別對其做了方差分析,可溶糖轉(zhuǎn)化率的方差分析如表3所示。

表3 可溶糖轉(zhuǎn)化率(Y1)模型的方差分析

從表3中看到,可溶糖轉(zhuǎn)化率模型(模型(2))的F檢驗(yàn)值為32.7,p值<0.0001,說明該模型是顯著的。同時(shí),對模型的Lack of Fit進(jìn)行檢驗(yàn),其p值為0.1812。當(dāng)Lack of Fit的p值>0.1時(shí),認(rèn)為是不顯著的,說明模型滿足預(yù)期假設(shè)。因此,該模型在統(tǒng)計(jì)上是證明可行的。同時(shí)模型中各項(xiàng)的方差分析表明,X1、X2、、和是模型中的顯著項(xiàng)(其p值均小于0.05),對因變量Y1起主要影響。方差分析得出,模型的R2值達(dá)到0.9768,說明模型具有很高的準(zhǔn)確性。

表4為葡萄糖轉(zhuǎn)化率模型(模型(3))的方差分析,同樣,其模型的F檢驗(yàn)值為158.5,p值< 0.0001,模型Lack of Fit的p值為0.1552,也說明了該模型在統(tǒng)計(jì)上的有效性。在對因變量Y2的影響上, X1、X2、X3、X1X2、、和都起顯著作用。模型的R2值高達(dá)0.9951,具有非常準(zhǔn)確的預(yù)測性。

表4 葡萄糖轉(zhuǎn)化率(Y2)模型的方差分析

2.4 響應(yīng)面曲線分析

圖3和圖4是分別根據(jù)數(shù)學(xué)模型(2)和模型(3),固定其中一個(gè)自變量而做出的三維響應(yīng)面曲線圖,直觀地表示出了溫度、酶用量和pH值3個(gè)因素對可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響。

從圖3(a)中可以看出,當(dāng)pH值控制在5.0時(shí),酶用量對可溶糖轉(zhuǎn)化率的影響大于溫度的影響?？扇芴寝D(zhuǎn)化率隨酶用量的增加而增加,但隨溫度在40～60℃范圍內(nèi)變化時(shí),表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢,說明在此溫度范圍內(nèi)會(huì)存在一個(gè)最優(yōu)溫度值使可溶糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值。圖3(b)為酶用量為6 g/L時(shí),溫度和pH值對可溶糖轉(zhuǎn)化率的影響。同溫度一樣,隨著pH值從3增加到7,可溶糖轉(zhuǎn)化率也先增加后減小。在此圖中存在一個(gè)明顯的頂點(diǎn),表明在實(shí)驗(yàn)的溫度和pH值范圍內(nèi),有一個(gè)最佳的組合,使可溶糖轉(zhuǎn)化率最高。圖3(c)是溫度在50℃時(shí),酶用量和pH值對可溶糖轉(zhuǎn)化率的影響。

圖4(a)、(b)、(c)為溫度、酶用量和pH值相互對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響,其與圖3(a)、(b)、(c)的形狀相似,但峰型有差異,說明3個(gè)因素對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響趨勢與其對可溶糖轉(zhuǎn)化率的影響趨勢相近,但是影響程度不相同。

2.5 漂白漿酶解影響因素的優(yōu)化

在實(shí)際應(yīng)用中,為了提高酶解效率,需要優(yōu)化反應(yīng)中的可變因素,達(dá)到期望的響應(yīng)值。在固定其他因素時(shí),可以利用模型(2)和模型(3)分別找出一組溫度、酶用量和pH值的取值組合,使可溶糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。模型的優(yōu)化取值使用Excel(Mi crosoftOffice Excel 2007)中的“規(guī)劃求解”(Solve Tool)工具。求解結(jié)果如表5所示。

表5 漂白漿酶解影響因素優(yōu)化取值

圖3 數(shù)字模型(2)三維響應(yīng)面曲線圖

圖4 數(shù)字模型(3)三維響應(yīng)面曲線圖

從表5中可以看出,當(dāng)溫度為52.8℃、酶用量為10 g/L和pH值為5.5時(shí),可溶糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大,為81.5%;當(dāng)溫度為45.9℃、酶用量為10 g/L和pH值為5.3時(shí),葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大,為54.3%。為了驗(yàn)證此結(jié)果,在此優(yōu)化條件下做了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)值和模型預(yù)測值的對比如表6所示。從表6可見,在優(yōu)化條件下得到的可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率的實(shí)驗(yàn)值與模型的預(yù)測值非常接近,說明模型(2)和模型(3)可準(zhǔn)確地優(yōu)化漂白漿酶解條件。

表6 優(yōu)化條件下實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測值的對比%

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面法中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對影響漂白針葉木漿纖維素酶水解的3個(gè)主要影響因素(溫度、酶用量和pH值)進(jìn)行了研究。通過回歸分析,得出了2個(gè)三元二次多項(xiàng)式方程分別用于預(yù)測酶解過程中的可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率。方差分析證明模型在統(tǒng)計(jì)上是顯著有效的,可用于準(zhǔn)確預(yù)測不同溫度、酶用量和pH值條件下的可溶糖轉(zhuǎn)化率和葡萄糖轉(zhuǎn)化率。通過對數(shù)學(xué)模型的規(guī)劃求解,得到了使響應(yīng)變量達(dá)到最大的優(yōu)化條件,分別為:當(dāng)溫度為52.8℃、酶用量為10 g/L和pH值為5.5時(shí),可溶糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大81.5%;當(dāng)溫度為45.9℃、酶用量為10 g/L和pH值為5.3時(shí),葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大54.3%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明了模型優(yōu)化的準(zhǔn)確性。

[1] Hon D N S.Cellulose:a random walk along its historical path[J]. Cellulose,1994,1(1):1.

[2] RagauskasA J,W illiams C K,Davison B H,et al.The path forward for biofuels and biomaterials[J].Science,2006,311:484.

[3] HimmelM E,Ding S Y,Johnson D K,et al.Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production[J].Science, 2007,315:804.

[4] Zhang Y H P,Lynd L R.Toward an aggregated understanding of en zymatic hydrolysis of cellulose:noncomplexed cellulase systems[J]. Biotechnology and Bioengineering,2004,88:797.

[5] Caulfield D F,MooreW E.Effect of varying crystallinity of cellulos on enzyme hydrolysis[J].Wood Sci.,1974,6:375.

[6] Szijarto N,Siika-aho M,Tenkanen M,et al.Hydrolysis of amorphou and crystalline cellulose by heterologously produced cellulasesofMelano carpus albomyces[J].Journal ofBiotechnology,2008,136(3/4):140.

[7] Fan L T,Lee Y H,Beardmore D H.Mechanis m of the enzymatic hy drolysis of cellulose:effectsofmajor structural featuresof cellulose on enzymatic hydrolysis[J].Biotechnol.Bioeng.,1980,22:177.

[8] Gupta R,Lee Y Y.Mechanis m of Cellulase Reaction on Pure Cellu losic Substrates[J].Biotechnology and Bioengineering,2009,102 (6):1570.

[9] Ir win D,SpezioM,WalkerL P,et al.Activity studies of eight puri fied cellulases:specificity,synergism and binding domain effects[J]. Biotechnol.Bioeng.,1993,42:1002.

[10] Bravo V,PaezM P,AouladM,et al.The influence ofpH upon th kinetic parameters of the enzymatic hydrolysis of cellobiose with No vozym 188[J].Biotechnology Progress,2001,17(1):104.

[11] Tengborg C,GalbeM,Zacchi G,et al.Influence of enzyme loadin and physicalparameterson the enzymatic hydrolysisof steam-pretrea ted softwood[J].Biotechnology Progress,2001,17(1):110.

[12] Bas D,Boyaci I H.Modeling and optimization I:Usability of re sponse surfacemethodology[J].Journalof Food Engineering,2007, 78(3):836.

[13] Myers R H,Montgomery D C.Response surface methodology: Process and product optimization using designed experiments[M]. New York:JohnW iley&Sons,Inc.,1995.

[14] BezerraM A,Santelli R E,Oliveira E P,et al.Response surfac methodology(RS M)as a tool foroptimization in analytical chemistr [J].Talanta,2008,76(5):965.

[15] Kalil S J,Maugeri F,RodriguesM I,et al.Response surface analysis and simulation as a tool for bioprocess design and optimization[J].ProcessBiochemistry,2000,35(6):539.

Abstract:Box-Behnken design in Response SurfaceMethodologywas employed to study the effects of temperature,cellulase dosage and pH on the efficiency of enzymatic hydrolysis of bleached softwood pulp.Two mathematic modelswere proposed to predict the conversion rates o soluble sugar and glucose.The three parameterswere optimized by solver tool inMicrosoft Excel.The optimal values of temperature,cellu lase dosage and pH formax imum soluble sugar conversion were found to be 52.8℃,10 g/L and 5.5,respectively.Those formaximum glu cose conversion were 45.9℃,10 g/L and 5.3,respectively.Comparing the experimental data and predicted data,the models were con firmed to be of high precision.

Keywords:cellulose;bleached pulp;enzymatic hydrolysis;response surface methodology

(責(zé)任編輯:常 青)

Opt im ization of Enzymatic Hydrolysis of Bleached Pulp by Response SurfaceM ethodology

LV Jian＊ZHAN Huai-yu FU Shi-yu

(State Key Lab of Pulp&Paper Engineering,South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong Province,510640)
(＊E-mail:lv.jian328@gmail.com)

TS71+1;TP27

A

1000-6842(2010)02-0016-06

2010-01-04(修改稿)

本課題為國家973計(jì)劃(2007CB210201)資助課題。

呂 健,男,1982年生;在讀博士研究生;研究方向:制漿化學(xué)與生物化學(xué)。

E-mail:lv.jian328@gmail.com