周文偉，劉月環(huán)

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，杭州 310013)

調(diào)查報(bào)告

實(shí)驗(yàn)兔出血癥病毒檢測(cè)方法的建立與免疫效果調(diào)查

周文偉，劉月環(huán)

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，杭州 310013)

目的檢測(cè)全省六個(gè)實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)的兔子所攜帶的兔出血癥病毒(RHDV)情況，調(diào)查實(shí)驗(yàn)兔RHDV抗體水平，評(píng)價(jià)不同疫苗的免疫效果，比較HAI與ELISA兩種方法的符合率。方法采用HAI、ELISA方法對(duì)1168份實(shí)驗(yàn)兔RHDV抗體進(jìn)行了檢測(cè)，并與RT－PCR方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果我省實(shí)驗(yàn)兔免疫情況較好，不同飼養(yǎng)場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)兔免疫合格率雖有不同，但未發(fā)生疫情。通過比較發(fā)現(xiàn)ELISA法檢測(cè)的抗體合格率明顯高于HAI法。結(jié)論LISA、HAI和RT－PCR方法均適合實(shí)驗(yàn)兔RHDV的檢測(cè)。

兔出血癥病毒(RHDV);血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HAI);酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA);反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(RT－PCR)

自1984年兔瘟疫情首次報(bào)道以來，該病幾乎波及全國(guó)所有的養(yǎng)兔地區(qū)。就浙江省而言，兔瘟疫情也一直沒有中斷過。在早期的研究中，人們主要集中于兔瘟的臨床診斷、治療、流行病學(xué)調(diào)查和組織滅活疫苗研究等方面。查明了該病的病原，初步弄清了RHDV發(fā)病特點(diǎn)，揭示了流行病學(xué)規(guī)律［1］。在疫病防控方面，由于沒有找到合適的細(xì)胞系，一直沒有被研制出細(xì)胞滅活苗，減毒疫苗株也無法進(jìn)行馴化。因此，兔瘟疫苗的制備主要依賴于發(fā)病兔組織的滅活。這種疫苗雖然很有效，但是生產(chǎn)安全難以保證，時(shí)刻存在散毒的危險(xiǎn)，生產(chǎn)成本也高。動(dòng)物疫情月報(bào)顯示，近年來，我省每年都有數(shù)十起兔瘟疫情的發(fā)生，給養(yǎng)兔業(yè)構(gòu)成巨大威脅。兔瘟病毒是一種RNA病毒，迄今該病毒是否發(fā)生了遺傳基因的變異?若有，則這些進(jìn)化性變異對(duì)病毒的致病性和流行病學(xué)有什么影響?當(dāng)前使用的兔瘟疫苗和防控措施是否仍然有效等，一直是懸而未決的問題。

根據(jù)浙江省科技廳關(guān)于“十一五”醫(yī)藥行業(yè)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)的發(fā)展與規(guī)劃，為確保我省醫(yī)藥業(yè)實(shí)驗(yàn)兔質(zhì)量，我們開展了兔出血癥病毒(RHDV)血清學(xué)檢測(cè)方法的研究，采用HAI、ELISA方法對(duì)從六個(gè)實(shí)驗(yàn)兔生產(chǎn)基地獲得的1168份兔血清進(jìn)行兔出血癥病毒檢測(cè)。同時(shí)用RT－PCR方法對(duì)上述樣品的全血進(jìn)行RHDV檢測(cè)，比較HAI與ELISA兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率。

1 材料和方法

1.1 血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HAI)

依據(jù) GB/T14926.21－2008，GB/T14926.54－2001中的方法。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

1.2.1 試劑盒的制備:采用 pET表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)的RHDV衣殼蛋白氨基端高抗原指數(shù)區(qū)作為抗原包被可拆96孔酶標(biāo)板，以辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG制備100倍濃縮酶結(jié)合物工作液，以間接ELISA法直接檢測(cè)兔血清樣品中的 RHDV抗體。樣品稀釋液為含吐溫 －20的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4);10×濃縮洗滌液為含吐溫－20的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4);100×濃縮底物貯存液為含四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的二甲基亞砜(DMSO)溶液;底物緩沖液為含過氧化氫的檸檬酸—磷酸鹽緩沖液;終止液為 2 mol/L硫酸溶液。陽性對(duì)照為經(jīng)RHDV組織滅活疫苗免疫新西蘭兔獲得的高免陽性血清;陰性對(duì)照為非RHDV免疫兔經(jīng)篩選獲得的血清。在進(jìn)行精密性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、敏感性等ELISA法常規(guī)指數(shù)測(cè)試后組裝。

1.2.2 檢測(cè)步驟:(1)將10×濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍即為洗滌液和酶標(biāo)二抗稀釋液;(2)將待檢血清用樣品稀釋液作1∶100稀釋，按100 μL/孔加入抗體檢測(cè)板中，同時(shí)設(shè)空白(只加100 μL樣品稀釋液)、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照每孔各 100 μL，37°C孵育45 min，甩干;(3)每孔加洗滌液200 μL，洗滌3次，每次間隔1 min，拍干;(4)用洗滌液將100×濃縮酶標(biāo)二抗貯存液稀釋 100倍至工作濃度，每孔加100 μL，37℃孵育45 min，甩干;(5)每孔加洗滌液200 μL，洗滌3次，每次間隔1 min，拍干; (6)用底物緩沖液將100×濃縮底物貯存液稀釋100倍至工作濃度，每孔加 100 μL，37℃避光孵育10 min;(7)加50 μL終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀取每孔光吸收值(A450 nm值)。

1.2.3 判定標(biāo)準(zhǔn):在陽性對(duì)照孔 A450＞0.5，陰性對(duì)照孔A450＜0.2的前提下，樣品孔A450/陰性對(duì)照孔A450≥2.1判定為陽性，樣品孔本身 A值 ＞0.2，反之為陰性。如果陽性對(duì)照孔A450＜0.5，或陰性對(duì)照孔A450＞0.2，表明試劑盒失效或檢測(cè)操作有誤，需重新檢測(cè)。

1.3 RT-PCR方法 見參考文獻(xiàn)［2］

1.4 樣品

1168份兔血樣來源于浙江省六個(gè)實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)(標(biāo)為Y，P，S，J，N，L)。采樣方式主要是兔耳動(dòng)脈血2 mL，均分為抗凝和不抗凝兩種，其中抗凝血用于RT－PCR法活體檢測(cè) RHDV病毒，不抗凝血用于HAI法和ELISA法檢測(cè)樣品RHDV疫苗免疫抗體效價(jià)。各場(chǎng)的數(shù)量分別是L場(chǎng)70份、S場(chǎng)316份、P場(chǎng)415份、Y場(chǎng)221份、J場(chǎng)64份、N場(chǎng)82份。

2 結(jié)果與分析

2.1 六個(gè)實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)實(shí)驗(yàn)兔RHDV血清抗體檢測(cè)

見表1，2，3。

表1 HAI法檢測(cè)RHDV血清抗體結(jié)果Tab.1 RHDV－positive cases detected by HAI

表2 ELISA法檢測(cè)RHDV血清抗體情況Tab.2 RHDV－postive cases detected by ELISA

表3 HAI法與ELISA法檢測(cè)RHDV抗體結(jié)果Tab.3 The coincidence rate of RHDV detection by HAI and ELISA

2.2 兩種檢測(cè)方法的比較

對(duì)HAI與 ELISA兩種檢測(cè)方法進(jìn)行了 Kappa檢測(cè)，結(jié)果見表4、表5。

表4 HAI與ELISA兩種檢測(cè)方法年度比較Tab.4 Analysis of the effect of sampling time on RHDV detection using kappa test

從數(shù)據(jù)可以看出，我省的實(shí)驗(yàn)兔免疫情況較好，各場(chǎng)的合格率雖有不同，但結(jié)果良好。通過對(duì)兩種方法的比較中，我們可以看出ELISA法檢測(cè)結(jié)果的合格率明顯高于HAI法。Kappa值(P＜0.01)在年度的比較中分別為0.77、0.783、0.828、0.696，在場(chǎng)間的比較中分別是J場(chǎng)0.775、L場(chǎng)0.959、N場(chǎng)0.864、P場(chǎng)0.838、S場(chǎng)0.829和Y場(chǎng)0.71。年度間檢測(cè)結(jié)果的一致性較好，場(chǎng)內(nèi)年度間檢測(cè)結(jié)果的一致性較高，說明該方法較為可靠。HAI雖然價(jià)格低廉，但操作復(fù)雜，結(jié)果的判定與觀察者的經(jīng)驗(yàn)有很大關(guān)系，而ELISA與其相比有明顯的優(yōu)勢(shì)，操作過程簡(jiǎn)單化，結(jié)果可以用儀器精確測(cè)定，準(zhǔn)確性高，適用于實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模的病毒檢測(cè)。國(guó)外研究表明ELISA比 HAI的假陽性率要低。［3］該法通常以抗RHDV的多克隆血清或針對(duì)RHDV衣殼蛋白上不同表位的單克隆抗體包被ELISA板進(jìn)行檢測(cè)，并可用于病毒抗原特性的研究。

在檢測(cè)的1168份實(shí)驗(yàn)兔全血中，可疑樣品有14份，分別是L場(chǎng)2、S場(chǎng)2、P場(chǎng)5只、Y場(chǎng)4只、N場(chǎng)1只，都在非免兔中，用 HAI進(jìn)行驗(yàn)證性檢測(cè)表明，3個(gè)是陰性;14個(gè)PCR陽性樣品中有10個(gè)HAI是陽性，3個(gè)陰性。檢測(cè)敏感度達(dá)100%，特異性為99.12%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，kappa=0.865，表明RT－PCR檢出RHDV的結(jié)果與HAI高度一致。上述14個(gè)可疑樣分布在 5個(gè)場(chǎng)中，進(jìn)一步跟蹤，未發(fā)現(xiàn)兔場(chǎng)疫情。

3 討論

表5 HAI與ELISA兩種檢測(cè)方法兔場(chǎng)之間比較Tab.5 Analysis of the effect of HAI and RHDV detection among different farms by kappa test

根據(jù)GB14922.2－2008，兔出血癥病毒(RHDV)是普通級(jí)實(shí)驗(yàn)兔必檢項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)兔免疫后的抗體水平需達(dá)到保護(hù)效價(jià)才算合格。同時(shí)，規(guī)定了抗體水平檢測(cè)方法為血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HAI)，病原檢測(cè)采用RT－PCR法。前二種方法均耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)樣品處理的方法和檢驗(yàn)人員技術(shù)經(jīng)驗(yàn)要求高，特別是紅細(xì)胞難以長(zhǎng)期保存。RT－PCR作為一種分子生物學(xué)技術(shù)現(xiàn)在已被廣泛地用于檢測(cè)各種病原微生物和寄生蟲，近年來我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物界也有將此項(xiàng)技術(shù)用于科研項(xiàng)目中的病原體檢測(cè)的一種探索，雖然該項(xiàng)技術(shù)還不是國(guó)標(biāo)規(guī)定的首選檢測(cè)方法，但由于其直接檢測(cè)病原體的遺傳物質(zhì)，具有特異性好，敏感性強(qiáng)，便于自動(dòng)化分析，省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，成為今后檢測(cè)病原體的一種主流方法。

間接ELISA法作為一種易于標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，主要通過基于該法生產(chǎn)的試劑盒及酶標(biāo)儀來實(shí)現(xiàn)，檢測(cè)用的試劑盒由包被抗原的96孔板，陰、陽性血清對(duì)照，酶標(biāo)二抗，底物及底物緩沖液，終止液，稀釋液及封板膜組成，該方法是目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制中普遍使用的方法。由于兔出血癥病毒一直沒有高純化的抗原，從而ELISA法檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)曾經(jīng)是難題。本研究在前期研究中已表達(dá)的蛋白研制出ELISA檢測(cè)試劑盒，為給我省制訂全面而有效的實(shí)驗(yàn)兔RHD防治措施提供理論依據(jù)和檢測(cè)方法支持，同時(shí)本課題實(shí)施后的兔 RHDV抗體ELISA法檢測(cè)試劑盒，已送全國(guó)九個(gè)省、市、自治區(qū)試用，結(jié)果大都反應(yīng)良好。

該病爆發(fā)后的早期，我國(guó)曾有報(bào)道認(rèn)為因兔出血癥疫苗均是組織滅活苗，個(gè)別批次確有因滅活不徹底而導(dǎo)致有些兔場(chǎng)在疫苗免疫后3～10 d或半月左右出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象，有些聯(lián)苗(兔瘟、巴桿二聯(lián))因單苗之間質(zhì)量不好，造成免疫失敗。但隨著制苗技術(shù)的成熟，無論單苗還是聯(lián)苗，有相同的免疫效果.聯(lián)苗(兔瘟、巴桿二聯(lián))品種間沒有干擾作用，并且巴桿為革蘭氏陰性小桿菌，其免疫活性質(zhì)多糖等成分具有優(yōu)劑效應(yīng)［4］。疫苗的貯存，一般認(rèn)為在(2～8)℃時(shí)可保存半年，25℃以下可保存半個(gè)月。疫苗的效價(jià)小于24時(shí)，會(huì)導(dǎo)致免疫失敗。調(diào)查中了解到，全省六個(gè)實(shí)驗(yàn)兔基地(場(chǎng))中，S場(chǎng)、N場(chǎng)和L場(chǎng)使用的是浙江省農(nóng)科院自制的兔瘟、巴桿二聯(lián)疫苗;J場(chǎng)和P場(chǎng)(2007年)使用的是南京天邦生物科技有限公司生產(chǎn)的兔病毒性出血癥單聯(lián)滅活疫苗;Y場(chǎng)和P場(chǎng)(2008年)使用的是齊魯動(dòng)物保健品公司生產(chǎn)的兔出血癥滅活疫苗。采用 ELISA為比較基準(zhǔn)，這幾個(gè)兔場(chǎng)的免疫合格率都達(dá)到70%以上，免疫方式上都是30～60日齡初免，均是頸部皮下注射，所不同是二免情況，各場(chǎng)根據(jù)存欄時(shí)間長(zhǎng)短安排二免，時(shí)間大致是初免一個(gè)月到半年內(nèi)，J場(chǎng)對(duì)于種兔還在第二年再兔一次。從免疫效果上看，三種疫苗均是組織滅活苗，六個(gè)兔場(chǎng)(生產(chǎn)基地)將疫苗購(gòu)回后均能進(jìn)行低溫保存和按規(guī)定使用，根據(jù)兩年來的檢測(cè)結(jié)果我們認(rèn)為疫苗質(zhì)量、免疫情況較好，沒有發(fā)生疫情。

另外，根據(jù)我們的調(diào)查，浙江省健康的實(shí)驗(yàn)兔中RHDV(14只陽性)仍然存在，其中3個(gè)PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性的樣本與用HAI法檢測(cè)結(jié)果不一致(該法檢測(cè)結(jié)果為陰性)，原因可能與RHDV的表達(dá)產(chǎn)物是否有活性有關(guān)。因此，今后對(duì)于該病的防控，兔場(chǎng)最好應(yīng)定期對(duì)兔病毒性出血癥 HAI抗體滴度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，滴度在24以下時(shí)即進(jìn)行免疫。同時(shí)，免疫前應(yīng)對(duì)疫苗效價(jià)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，血凝價(jià)低于24時(shí)，應(yīng)停止使用該批疫苗。我們主張每個(gè)場(chǎng)繼續(xù)保持現(xiàn)有的免疫方式和疫苗來源，以鞏固目前的防御效果為目標(biāo)，但因調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)健康兔群中RHDV依然存在，因此對(duì)該病就應(yīng)該給予足夠的重視，按時(shí)免疫和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，防止因?yàn)橐呙绫４婊蚬芾聿簧圃斐擅庖呤亩兄乱咔楸l(fā)。

［1］ Sánchez－Campos S，Alvarez M，Culebras JM，et al.Pathogenic molecular mechanisms in an animal model of fulminant hepatic failure:Rabbit hemorrhagic viral disease［J］.The J Lab Clin Med，2004，144(4):215－222.

［2］ 劉月環(huán)，樓琦，金曉音，等.兔出血癥病毒遺傳變異分析及RT－PCR檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18 (11):44－49.

［3］ Rodak L et al.Enzyme－linked immunosorbent assay of antibodies to rabbit hemorrhagic disease virus and determination of its major structural proteins.J Gen Virol，1990，71:1075－1080.

［4］ 佟承剛.家兔出血癥疫苗免疫失敗原因及對(duì)策［J］.中國(guó)養(yǎng)兔雜志，1996，6:30－31.

Establishment of Three Methods for Detection of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus in Rabbits and Investigation of Their Immunization Effects

ZHOU Wen－wei，LIU Yue－h(huán)uan
(Zhejiang Provincial Center of Laboratoy Animals，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China)

ObjectiveTo investigate the rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV)prevalence in six rabbits farms in Zhejiang province，and evaluate the immunization effects of Zhejiang RHDV rabbit vaccines。Methods1168 serum samples of laboratory rabbits were tested for the RHDV by hemagglutination inhibition(HAI)and ELISA assays. RT－PCR was employed to detect the RHDV prevalence。ResultsImmunization of rabbits in our province was good，although the passing rate was varying，there was no epidemic outbreak.By the two indirect serum detection methods，HAI and ELISA，the passing rate of ELISA method was significantly higher than that of the HAI method。Conclusions Three detection methods have been established，suitable for the detection and control of RHDV in laboratory rabbits in Zhejiang province.It provides an effective means of detection，prevention and control of rabbit hemorrhagic disease outbreak.

Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV;Hemagglutination inhibition，HAI;Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA;Reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR

R－33

A

1671－7856(2010)04－0059－04

2009－12－15

浙江省科技廳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007F80011)。

周文偉(1969－)，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向:動(dòng)物醫(yī)學(xué)，E－mail:hh5498@126.com。

劉月環(huán)(1974－)，女，副研究員，碩士，研究方向:生物技術(shù)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物育種，E－mail:yuehuanliu@163.com。