劉秀芝 席曄斌 李榮平 陳廣潔 王保國(guó) 蔣黎華 李偉毅

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室上海市免疫學(xué)研究所,上海200025)

·生殖免疫學(xué)·

Toll樣受體對(duì)睪丸Sertoli細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的初步研究①

劉秀芝 席曄斌 李榮平 陳廣潔 王保國(guó) 蔣黎華 李偉毅

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室上海市免疫學(xué)研究所,上海200025)

目的:研究睪丸Sertoli細(xì)胞感染后,T LR發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的情況。方法:正常大鼠Sertoli細(xì)胞表達(dá)T oll樣受體的情況以及用溶脲脲原體(Ureaplasma Urealyticum,UU)體外感染Sertoli細(xì)胞后,分別在12、24、36小時(shí)時(shí)間段比較感染組與對(duì)照組之間T oll樣受體表達(dá)變化情況。結(jié)果:正常大鼠Sertoli細(xì)胞表達(dá)T LR2-8,低表達(dá)T LR9和10,未檢出T LR1和5;與對(duì)照組相比,體外感染處理后T LR2、6表達(dá)增加。結(jié)論:T oll樣受體的激活參與Sertoli細(xì)胞對(duì)炎癥的免疫調(diào)節(jié),兩者具有一定的聯(lián)系。

大鼠;T oll樣受體;支持細(xì)胞;免疫調(diào)節(jié)

睪丸位于陰囊內(nèi),是雄性動(dòng)物的主要生殖器官之一,具有生精和內(nèi)分泌作用。Sertoli細(xì)胞(支持細(xì)胞)是睪丸的基質(zhì)細(xì)胞,主要參與血-睪屏障的構(gòu)建、分泌細(xì)胞因子,它是唯一與生精細(xì)胞接觸的體細(xì)胞,以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能為精子發(fā)生提供適宜的微環(huán)境,對(duì)精子的發(fā)生、成熟、獲能等起到重要作用[1]。此外,Sertoli細(xì)胞還是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞[2,3],在睪丸局部抗感染免疫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,其Fas-FasL系統(tǒng)參與維持大鼠睪丸的免疫豁免作用[4,5]。

[Abstract]oll樣受體(T oll-like receptor T LR)是天然免疫系統(tǒng)中特異的I型跨膜受體和病原模式識(shí)別受體。T LR在急性炎癥反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡中起重要作用。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)人類(lèi)表達(dá)10種T oll樣受體,小鼠表達(dá)13種[6]。大腸桿菌感染大鼠睪丸后能引起T LR4的表達(dá)變化,激活My-D88非依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,產(chǎn)生炎性因子[7]。本實(shí)驗(yàn)主要研究睪丸Sertoli細(xì)胞體外感染UU時(shí),Sertoli細(xì)胞表達(dá)T LR的情況,探索其與睪丸免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑15～18日齡雄性SD大鼠50只(Sprague Dawley,30～40克,此時(shí)睪丸未降至腹腔),購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部。膠原酶Ⅱ型、透明質(zhì)酸酶均購(gòu)自Worthington公司。DMEM/F-12培養(yǎng)液購(gòu)自Sigma公司。解脲支原體選擇分離培養(yǎng)試劑盒(UU培養(yǎng)液)購(gòu)自上海恩康生物科技公司。FITC標(biāo)記的山羊抗兔-IgG抗體購(gòu)自 KPL公司。Mouse IgG1 Isotype Controlo購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。兔抗T LR2(H-175)和T LR6(H-90)購(gòu)自Santa Cruz公司。2×PCR Master Mix試劑盒(K0171)和MaximaTMSY BR Green QPCR Master Mix(2×)購(gòu)自Fermentas公司。流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)購(gòu)自BD公司。

1.2 UU體外培養(yǎng) 血清8型標(biāo)準(zhǔn)菌株(T960)由加拿大Alberta大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物和傳染病研究所Robeston博士惠贈(zèng),將UU標(biāo)準(zhǔn)株T960(凍干品)復(fù)蘇,于無(wú)菌條件下接種于UU培養(yǎng)基中(該培養(yǎng)基是在GC培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加血紅蛋白、血清、酵母提取物、增菌劑、抑菌劑和鹽類(lèi)等制成),37℃孵育18～24小時(shí),觀察結(jié)果。若培養(yǎng)基顏色由黃色轉(zhuǎn)變成為橙紅色,且上清液清亮無(wú)混濁,表明UU生長(zhǎng)良好無(wú)污染。將0.2 ml上述培養(yǎng)液接種至2 ml新鮮培養(yǎng)液內(nèi),如此反復(fù)接種2～3次,每次孵育16～18小時(shí),培養(yǎng)液顯示橙紅色,此時(shí)UU處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、繁殖速度最快、活力最強(qiáng),作為試驗(yàn)用UU。

1.3 UU效價(jià)滴定 UU效價(jià)以顏色變化單位(Color-Changing Units,CCU/ml)表示。將上述培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的UU倍比稀釋,接種于40孔培養(yǎng)板中,37℃孵育48小時(shí),觀察結(jié)果。顏色變紅的最高稀釋孔的稀釋度即為UU效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)所用效價(jià)為1×105CCU/ml。

1.4 方法

1.4.1 Sertoli細(xì)胞的分離 SD大鼠頸椎脫臼處死,無(wú)菌條件下取出睪丸組織,仔細(xì)剝離被膜和血管,用無(wú)菌PBS反復(fù)沖洗。剪碎為1 mm3,用0.75%Ⅱ型膠原酶和0.2%透明質(zhì)酸酶消化30分鐘,再用0.15%Ⅱ膠原酶和0.04%透明質(zhì)酸酶消化45分鐘,并經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾,用無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×105ml-1種于24孔培養(yǎng)板中,于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。24小時(shí)后吸棄培養(yǎng)液,用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)低滲處理3～5分鐘去除大部分精原細(xì)胞,用PBS沖洗后可獲得高純度Sertoli細(xì)胞(>95%)[8],加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 UU感染Sertoli細(xì)胞 達(dá)到實(shí)驗(yàn)效價(jià)要求的UU以200μl/孔的量分別加于實(shí)驗(yàn)組各孔中?？瞻讓?duì)照組與已感染 UU的實(shí)驗(yàn)組 Sertoli細(xì)胞均在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.4.3 RT-PCR反應(yīng) 細(xì)胞總RNA抽提按TRIzol試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,并經(jīng)紫外分光光度儀測(cè)定濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按SuperscriptⅡ試劑盒中的說(shuō)明書(shū)操作。Premier5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的11種PCR引物見(jiàn)表1。取cDNA3μl(1μg),2×PCR Buffer 12.5μl,引物100 ng,加Water(nuclease-free)至25μl。循環(huán)條件:94℃預(yù)變性3分鐘,94℃變性46秒,退火1分鐘(T LR1-4,T LR6-10,β-actin 55℃,T LR5 58℃), 72℃延伸80秒,共30個(gè)循環(huán),72℃共延伸10分鐘。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物25μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(凝膠濃度15 g/L),用凝膠成像系統(tǒng)及分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶分析,β-actin作為內(nèi)參照,標(biāo)準(zhǔn)化各組 T LR mRNA含量。

1.4.4 Real-Time PCR檢測(cè)T LR2和 T LR6表達(dá)MaximaTMSY BR Green qPCR Master Mix(2×)12.5μl,上下游引物各0.5μmol/L,cDNA<500 ng,Water(nuclease-free)至25μl。兩步循環(huán):50℃預(yù)處理2分鐘,初變性95℃10分鐘,95℃15秒變性,60℃60秒退火延伸40個(gè)循環(huán)。計(jì)算2-ΔΔCT值。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T LR2和T LR6表達(dá) 對(duì)照組和UU刺激12、24、36小時(shí)的實(shí)驗(yàn)組貼壁Sertoli細(xì)胞,先用0.25%胰酶消化,再按3×105細(xì)胞/管加入流式細(xì)胞管中,然后用預(yù)冷PBS(含1 000 mg/L BSA)洗滌,1∶500稀釋的兔抗大鼠T LR2、T LR6及純化的Mouse IgG1 Isotype Controlo各20μl/管37℃孵育1小時(shí),加20μl FITC標(biāo)記的山羊抗兔-IgG抗體,室溫避光15～20分鐘,2%多聚甲醛固定,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T LR2和T LR6的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用兩樣本均數(shù)比較,t檢驗(yàn)(t檢驗(yàn)前先做兩樣本的方差齊性檢測(cè)),分析軟件為SPSS11.0.1。

2 結(jié)果

2.1 在倒置顯微鏡下觀察Sertoli細(xì)胞可見(jiàn)有單個(gè)的細(xì)胞,亦有7～8個(gè)細(xì)胞形成的小細(xì)胞團(tuán),24小時(shí)后完全貼壁,以多角形展開(kāi),呈片狀,胞質(zhì)中含脂滴,在無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周,細(xì)胞仍貼壁,生長(zhǎng)良好,與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致。Sertoli細(xì)胞生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1(24小時(shí)貼壁情況)。分離培養(yǎng)兩天后的細(xì)胞經(jīng)透射顯微鏡分析、鑒定,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有2～3個(gè)核仁,細(xì)胞間有緊密連接,為典型的Sertoli細(xì)胞,見(jiàn)圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察到的Sertoli細(xì)胞(1∶100)Fig.1 Microscopy of isolated Sertoli cells(1∶100)

2.2 正常大鼠Sertoli細(xì)胞表達(dá)T LRs的情況 體外培養(yǎng)的Sertoli細(xì)胞經(jīng)50 mmol/L Tris-HCl緩沖液純化處理后,提取細(xì)胞總RNA,用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)T LR的情況,得知正常Sertoli細(xì)胞高表達(dá)T LR2-8,低表達(dá)T LR9和10,未檢出T LR1和5表達(dá),見(jiàn)圖3。

2.3 UU感染后 T LR mRNA表達(dá)情況 Real-time QPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UU感染Sertoli細(xì)胞12小時(shí)后,與對(duì)照組相比T LR2的mRNA含量顯著增加并持續(xù)到24小時(shí)(P<0.05),而在36小時(shí)開(kāi)始降低;與對(duì)照組相比T LR6的mRNA含量在12小時(shí)開(kāi)始增加,24小時(shí)顯著增多(P<0.01),而在36小時(shí)開(kāi)始降低,見(jiàn)圖4。 2.4 UU感染后T LR2和T LR6蛋白水平表達(dá)變化情況 流式檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明UU感染24小時(shí)后,T LR2的表達(dá)顯著增加至83.39%±6.65%,而在36小時(shí)降至39.81%±4.32%,與同時(shí)間段mRNA水平的變化情況一致;感染24小時(shí)后T LR6的水平也是顯著增加,而在36小時(shí)表達(dá)降低,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖5,表2、3。

圖2 電鏡下觀察到的Sertoli細(xì)胞Fig.2 Electron micrograph of cultured Sertoli cells

圖3 正常大鼠Sertoli細(xì)胞TLR mRNA的表達(dá)情況Fig.3 The expression levels of TLRs mRNA in normal rat Sertoli cell

圖4 不同時(shí)間段TLR2 mRNA和TLR6 mRNA在正常對(duì)照組與感染組的表達(dá)Fig.4 The expression levels of TLR2 mRNA and TLR6 mRNA in normal controls and infected group in different times

表1 RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR使用的引物序列表Tab.1 The primers in RT-PCRand Real-time PCR

圖5 UU感染Sertoli細(xì)胞后TLR2和TLR6的表達(dá)變化Fig.5 The expression levels of TLR2 and TLR6 in normal controls and infected group

表2 不同時(shí)間段UU感染對(duì)TLR2 mRNA及蛋白水平的影響Tab.2 The effect of UU on expression of TLR2 mRNA and protein in Sertoli cells

表3 不同時(shí)間段UU感染對(duì)TLR6 mRNA及蛋白水平的影響Tab.3 The effect of UU on expression of TLR6 mRNA and protein in Sertoli cells

3 討論

[Abstract]LRs是一類(lèi)誘導(dǎo)早期天然免疫,并與隨后的適應(yīng)性免疫應(yīng)答一起調(diào)控細(xì)胞間相互作用的受體。T LRs最初是作為一種參與果蠅胚胎背腹軸形成的重要蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)的。1997年人類(lèi)T oll蛋白的氨基酸序列被報(bào)道,因其與果蠅T oll蛋白的結(jié)構(gòu)同源性較高,故稱(chēng)之為 T oll樣受體(T oll-like receptors, T LRs)[10]。目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)十幾種T LRs,其中T LR1-9是人和小鼠共有的。

哺乳動(dòng)物的T LRs在結(jié)構(gòu)上分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)與其識(shí)別PAMPs功能相關(guān),富含亮氨酸(故又稱(chēng)為L(zhǎng)RR區(qū),leucine rich repeat domain);胞內(nèi)區(qū)與T LRs信號(hào)傳導(dǎo)功能相關(guān)并與Z L.1、Z L.18受體胞內(nèi)區(qū)高度保守,而稱(chēng)作TIR區(qū)(T oll interleukin 1 receptor domain)。大部分T LRs都參與識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)的高度保守的微生物成分,例如對(duì)肽聚糖及真菌類(lèi)的酵母等的識(shí)別是通過(guò)T LR2介導(dǎo)的;對(duì)脂多糖(LPS)的識(shí)別是通過(guò)T LR4介導(dǎo)的[11]。T LRs是最重要的模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs),哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)通過(guò)多種 T LRs與其各種配體的相互作用識(shí)別病原微生物的入侵,并激發(fā)體內(nèi)免疫效應(yīng)。

國(guó)內(nèi)外眾多研究發(fā)現(xiàn)不明原因不育男性精液中UU的檢出率明顯高于正常生育男性,提示UU感染與男性不育有密切關(guān)系[12]。它在大鼠生殖系統(tǒng)能長(zhǎng)期寄生并遷移,造成睪丸組織廣泛病理改變、生精細(xì)胞凋亡[13]。睪丸有兩道防御屏障,一是睪丸巨噬細(xì)胞和Leydig細(xì)胞,二是管周平滑肌細(xì)胞和Sertoli細(xì)胞。TNF-α能激活MAPK途徑和NF-κB途徑,導(dǎo)致Sertoli細(xì)胞產(chǎn)生粘附分子ICAM-1和VCAM-1,引起IL-6的增加[14]。T LRs不僅可以通過(guò)固有免疫發(fā)揮防御作用,而且可啟動(dòng)特異性免疫。本實(shí)驗(yàn)中,我們用RT-PCR檢測(cè)了大鼠睪丸Sertoli細(xì)胞表達(dá)T LRs mRNA的情況,結(jié)果表明其能組成性高表達(dá)T LR2-8,低表達(dá)T LR1、9、10,與文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠表達(dá)情況類(lèi)似[15]。

[Abstract]ertoli細(xì)胞是生精上皮中唯一與精原細(xì)胞接觸的體細(xì)胞,它參與維持免疫豁免,防御病原微生物入侵。T LR2和T LR6可聯(lián)合識(shí)別革蘭陽(yáng)性菌的成分如肽多糖、脂肽、脂蛋白和霉?jié){菌的脂肽[16]。Shimizu等[17]證實(shí)UU的脂蛋白p75和p55等MB抗原能激活NF-κB信號(hào)途徑,誘導(dǎo)T LR1、2、6的增加。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明:UU感染Sertoli細(xì)胞12小時(shí)后,與對(duì)照組相比T LR2和T LR6的mRNA含量開(kāi)始增加,24小時(shí)繼續(xù)增多,36小時(shí)開(kāi)始降低。同時(shí),流式細(xì)胞儀檢測(cè)T LR2和T LR6的蛋白水平表明,UU感染Sertoli細(xì)胞24小時(shí)時(shí),T LR2明顯增加,36小時(shí)T LR2和T LR6的表達(dá)下降,這與Real-Time QPCR的結(jié)果相符,說(shuō)明在感染早期,T LRs發(fā)揮防御作用。

我們下一步研究中,將在蛋白水平檢測(cè)UU感染Sertoli細(xì)胞后信號(hào)途徑的激活情況,用T LR受體抑制劑抑制NF-κB、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,觀察信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后,哪些細(xì)胞因子的分泌會(huì)發(fā)生變化,從而說(shuō)明細(xì)胞因子對(duì)應(yīng)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。同時(shí)會(huì)進(jìn)一步深入研究ZNF265對(duì)T LR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。

1 Fijak M,Menhardt A.The testis in immune privilege[J].Immunol Rev, 2006;213(10):66-81.

2 Restifo N P.Not so Fas:re-evaluating the mechanismsof immune privilege and tumor escape[J].Nat Med,2000;6(5):493-495.

3 Green D R,Ferguson TA.The role of Fas ligand in immune privilege[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2001;2(12):917-924.

4 陳廣潔,李偉毅,席曄斌 et al.睪丸局部感染時(shí)Sertoli細(xì)胞IL-1、IL-6mRNA的表達(dá)[J].免疫學(xué)雜志,2002;18(1):41-43.

5 王 煒,嚴(yán)律南,趙永恒.睪丸支持細(xì)胞免疫豁免功能的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代普通外科學(xué)進(jìn)展,2004;7(1):23-25.

6 Takeda K,Akira S.T oll-like receptors in innate immuity[J].Int Immunol,2005;17:1-14.

7 Bhushan S,Tchatalbachev S,K lugJet al.Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells[J].Immunol,2008;180(8):5537-5547.

8 李寶國(guó),徐群淵,高福祿.大鼠睪丸細(xì)胞與精原細(xì)胞的分離及共培養(yǎng)[J].解剖學(xué)報(bào),2007;38(1):118-120.

9 黃東暉,趙 虎,田永紅 et al.大鼠睪丸支持細(xì)胞的分離、純化和鑒定[J].解剖學(xué)報(bào),2007;38(2):246-249.

10 Medzhitoy R,Preston-Hurlburt P,Janeway C A.A human homologene of the drosophila toll protein signals activation of adaptive immunity[J]. Nature,1997;388(6640):394-397.

11 Eckert M,Wittmann I,Rollinghoff Met al.Endotoxin-induced expression of murine bacteridal permeabilityor increasingprotein is mediated exclusively by T oll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-beta-dependent pathways[J].Immunol,2006;176(1):522-528.

12 Xu C,Wang Y F.Localization of Ureaplasma umalyticum on human sperm atozoa[J].Reprod Contracept,1994;5(3):8-18.

13 Shang XJ,Huang Y F,Xiong C Let al.Ureaplasma umalyticum infection and apoptosis of spermatogenic cells[J].Asian J Androl,1999;1 (3):127-129.

14 Ricciooli A,Starace D,Alessio A Det al.TNF-αand IFN-γregulate expression on andfunctionof the Fas syetem in the seminiferous epithelium [J].Immunol,2000;165(2):743-749.

15 Wu H,Wang H,Xiong Wet al.Expression patterns and functions of T oll-like receptors in mouse Sertoli cells[J].Endocrinology,2008;149 (9):4402-4412.

16 Akeuchi O,Hoshino K,Kawai Tet al.Differential roles of T LR2 and T LR4 in recognitionof gramnegative and gram-positive bacterial cell wall components[J].Immunity,1999;11(3):443-451.

17 Shimizu T,K ida Y,Kuwano K.Ureaplasm parvum lipoproteins,including MB antigen,activate NF-κB through T LR1,T LR2 and T LR6[J].Microbiology,2008;154(5):1318-1325.

[收稿2009-07-22 修回2009-12-07]

(編輯 許四平)

The preliminary research of relationship between Toll-like receptor and the immunoloregulation of Sertoli cell

LIU Xiu-Zhi,XI Ye-Bin,LI Rong-Ping,CHENG Guang-Jie,WANG Bao-Guo,JIANG Li-Hua,LI Wei-Yi.Department of Immunology,Shanghai Jiaotong University Medical School,Shanghai Institute of Immunology,Shanghai200025,China

Objective:T o investigate the relationship between T oll-like receptor and the immune regulation about inflammation by Sertoli cell in vitro.Methods:Here we examined the expression and potential functions of T LRfamily in rat Sertoli cells.Usingour well-characterized urealyticum(UU)induced model we tested the expression changes of T LR2 and T LR6 at12th,24th,36thhours after UU infection in vitro. Results:We demonstrated that T LR2-8 are highly expressed;T LR9 and T LR10 are expressed at relatively low level;the expression of T LR1 and T LR5 are not detected in normal rat Sertoli cells.Comparing with control group,Sertoli cells express more T LR2 and T LR6 after infected by UU.Conclusion:There is some relationship between the activation of T LRs and the immune regulation about inflammation by Sertoli cell.

Rat;T oll-like receptor;Sertoli cell;Immunoloregulation

R392.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-484X(2010)02-0155-05

①本文受上海市教育委員會(huì)科研創(chuàng)新項(xiàng)目-重點(diǎn)項(xiàng)目(No.09ZZ117)和上海市免疫學(xué)研究所科研項(xiàng)目資助(08A05)

劉秀芝(1983年-),女,碩士,主要從事生殖免疫、免疫調(diào)節(jié)研究,E-mail:xiuzhiliu1028@163.com;

及指導(dǎo)教師:李偉毅(1953年-),男,教授,主要從事生殖免疫調(diào)節(jié)的研究,E-mail:liweiyi@sjtu.edu.cn。