許云云 王 泳 李毅平 李 芳 徐小霞 朱守兵 張學(xué)光

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所,蘇州215007)

IL-7對胸腺T細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞體外分化發(fā)育的影響①

許云云 王 泳 李毅平 李 芳 徐小霞 朱守兵 張學(xué)光

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所,蘇州215007)

目的:探討IL-7對胸腺T細(xì)胞及胸腺樹突狀細(xì)胞分化的影響。方法:摘取15～16日齡胎鼠胸腺進(jìn)行體外器官培養(yǎng)(胚胎胸腺器官培養(yǎng)-FTOC),分別將細(xì)胞因子IL-7和培養(yǎng)基滴加在胸腺小葉上,12天后收集不同條件下經(jīng)FTOC培養(yǎng)獲得的胸腺細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子CD4、CD8、CD11c、B220、Ia等的表達(dá),通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),通過細(xì)胞計數(shù)檢測細(xì)胞數(shù)目的變化。再將經(jīng)FTOC培養(yǎng)獲得的胸腺細(xì)胞和異源的T細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),通過MTT法檢測T細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果:細(xì)胞計數(shù)結(jié)果表明添加外源性IL-7組的胸腺細(xì)胞數(shù)目明顯減少,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示其中胸腺CD4-CD8-雙陰性細(xì)胞及CD8+單陽性細(xì)胞比例有所增加,而CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞比例顯著下降,CD4+單陽性細(xì)胞比例沒有明顯變化;此外,B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞數(shù)量均有不同程度的增加。結(jié)論:IL-7在胸腺T細(xì)胞及胸腺樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

胚胎胸腺器官培養(yǎng);IL-7;胸腺T細(xì)胞;胸腺樹突狀細(xì)胞

胸腺是T細(xì)胞分化、成熟的中樞免疫器官,也是馴化和選擇T細(xì)胞的場所。在T細(xì)胞分化、成熟過程中,發(fā)生選擇作用,即陽性選擇和陰性選擇[1,2]。胸腺輸出T細(xì)胞數(shù)量與質(zhì)量直接影響免疫系統(tǒng)整體功能。胸腺微環(huán)境是不可替代的,不但提供胸腺細(xì)胞發(fā)育所需一系列細(xì)胞因子,胸腺細(xì)胞與胸腺基質(zhì)細(xì)胞之間的接觸也至關(guān)重要。

IL-7在胸腺的分化發(fā)育過程中是一種必需的細(xì)胞因子[3-5]。目前,許多體外實驗已經(jīng)證明 IL-7影響胸腺前體細(xì)胞的分化發(fā)育[6-9]。Varas等[10]發(fā)現(xiàn),在大鼠的胚胎胸腺器官培養(yǎng)(FTOC)中加入IL-7,能促進(jìn)胸腺樹突狀細(xì)胞的生成。

本文中,我們運(yùn)用胚胎胸腺器官培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)IL-7在小鼠胸腺細(xì)胞分化、發(fā)育以及胸腺中的樹突狀細(xì)胞生成具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8～12周齡雌、雄性C57BL/6小鼠和SCID小鼠購自中國科學(xué)院實驗動物中心,不同日期的孕鼠由本室負(fù)責(zé)交配。

1.1.2 實驗試劑RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(FCS)、小牛血清(CS)、丙酮酸鈉、非必需氨基酸, 2-巰基乙醇(2-ME)、維生素和HEPES購自美國 G ibco公司;rmIL-7購自美國R&D公司;磷酸鹽緩沖液(PBS),Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購自上海生化試劑二廠;熒光標(biāo)記抗體:FITC或PE標(biāo)記的CD4、CD8、CD11c、CD11b、B220、NK1.1、Ia大鼠抗小鼠的標(biāo)識抗體購自美國eBioscience公司。

1.1.3 實驗儀器MACS設(shè)備(德國Miltenyi公司);0.8μm微孔濾膜(英國Whatman公司);組織器官培養(yǎng)皿(美國BD falcon公司);Terasaki培養(yǎng)板(日本Sumitomo Bakelite公司);70μm尼龍濾器(美國BD公司);實體顯微鏡(日本Nikon公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);流式細(xì)胞儀(美國Beckman-Coulter公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 孕鼠交配與鑒定 性成熟雌性小鼠2～3只和雄性小鼠1～2只于前一天下午五點左右合籠,隔日晨九時左右取出雌性小鼠,以見到陰栓形成為確認(rèn)懷孕日期,并計算為0.5 dpc(Day postcoitus),將其單獨飼養(yǎng),在12天時觀察小鼠腹部確認(rèn)是否懷孕, 15.5～16.5 dpc解剖孕鼠,摘取胎鼠的胸腺小葉用于實驗。

實驗分為兩組:對照組和 IL-7組,對照組為FTOC完全培養(yǎng)基,IL-7組為含 IL-7(20 ng/ml)的FTOC完全培養(yǎng)基。

1.2.2 胎鼠胸腺的獲取及胎鼠的胸腺器官培養(yǎng)取孕齡15.5～16.5天的雌鼠,頸椎脫臼處死,70%酒精浸泡10分鐘左右,打開其腹腔取出胎鼠,置于含2%～3%小牛血清無鈣鎂PBS的平皿中,于實體顯微鏡下解剖胎鼠,取出胸腺小葉,置于組織器官培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)皿的中心槽內(nèi)預(yù)先加入1.7～2.0 ml的FTOC培養(yǎng)基(RPMI1640,含20%胎牛血清、1 mmol/L丙酮酸鈉、1×MEM非必需氨基酸、50μmol/ L 2-ME、1×MEM維生素、20 mmol/L HEPES),中心槽上方放置金屬濾網(wǎng),濾膜置于濾網(wǎng)的中央,胸腺小葉位于濾膜之上,5～6對/皿。培養(yǎng)皿的周圍槽內(nèi)加入2 ml無菌蒸餾水,以保持整個培養(yǎng)環(huán)境的濕度。于37℃、5%CO2中培養(yǎng),每2天更換培養(yǎng)液。

1.2.3 細(xì)胞計數(shù)及流式細(xì)胞儀檢測 制備胸腺細(xì)胞懸液,即先在培養(yǎng)皿中加入含小牛血清的PBS,將尼龍濾器置入其中,取出FTOC中的胸腺小葉,于濾器中研磨,經(jīng)PBS洗滌之后,計數(shù),棄上清,加入各FITC/PE標(biāo)記抗體,混勻,于4℃中孵育20～30分鐘,PBS洗兩次后,用500μl PBS重懸細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞表型。

1.2.4 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 取6～8周BALB/c小鼠的新鮮脾臟,研磨后經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離(細(xì)胞懸液∶分離液=1.5～2∶1),2 200 r/min、20℃離心20分鐘,得BALB/c小鼠脾臟單個核細(xì)胞。將所得細(xì)胞以2×106～3×106ml-1種于6孔板中,貼壁2小時后,輕輕吸取未貼壁細(xì)胞,計數(shù),所得經(jīng)初步純化的單個核細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞。將FTOC體系培養(yǎng),并IL-7處理12天,獲得的胸腺細(xì)胞為刺激細(xì)胞。將反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞按比例混合,種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。分6個組:培養(yǎng)基對照組(含10%CS的RPMI 1640);實驗對照組,即反應(yīng)細(xì)胞組,僅含BALB/c小鼠來源的單個核細(xì)胞(105/孔);A、B、C、D組為實驗組,含按比例混合的反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞,A組反應(yīng)細(xì)胞∶刺激細(xì)胞=300∶1;B組反應(yīng)細(xì)胞:刺激細(xì)胞= 100∶1;C組反應(yīng)細(xì)胞∶刺激細(xì)胞=30∶1;D組反應(yīng)細(xì)胞∶刺激細(xì)胞=10∶1。于37℃、5%CO2中孵育4天后,用MTT法檢測T細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 光學(xué)顯微鏡形態(tài)學(xué)方法 經(jīng)FTOC體系培養(yǎng)12天后,同流式細(xì)胞儀檢測步驟分別收集IL-7組和對照組的細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 以 x—±s表示。以SPSS Version10.0軟件處理,P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 IL-7促進(jìn)CD8+胸腺細(xì)胞及雙陰性細(xì)胞的生成

在胎鼠胸腺器官培養(yǎng)體系中,摘取胎齡為15.5～16.5 dpc胎鼠的胸腺小葉,加入IL-7體外培養(yǎng)12天后,經(jīng)雙色熒光標(biāo)記后流式細(xì)胞儀分析顯示:CD4+CD8+胸腺細(xì)胞比例下調(diào),CD4-CD8+胸腺細(xì)胞及CD4-CD8-雙陰細(xì)胞的比例上調(diào)(圖1)。由細(xì)胞計數(shù)結(jié)果可見,在IL-7作用下,體外胸腺器官培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞總數(shù)減少,但是CD8+胸腺細(xì)胞及CD4-CD8-雙陰細(xì)胞絕對數(shù)量明顯增加(表1)。

2.2 IL-7促進(jìn)胸腺中其他免疫細(xì)胞的生成 胸腺小葉經(jīng)胎鼠胸腺器官培養(yǎng)體系培養(yǎng)12天后,FCM檢測結(jié)果顯示(圖2):IL-7組MHCⅡ、CD11c、B220、CD11b、NK1.1的表達(dá)明顯上調(diào),分別由36.2%、7.5%、3.6%、7.4%、2.3%增加至44.9%、70.7%、16%、21%、12.7%。其中,髓系樹突狀細(xì)胞(B220-CD11c+,conventional dendritic cells,cDC)和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(B220+CD11c+,plasmacytoid dendritic cells,pDC)的表達(dá)明顯高于對照組。由此提示,IL-7可友效促進(jìn)胸腺內(nèi)其他免疫細(xì)胞:B、NK、DC細(xì)胞的生成。

圖1 IL-7對FTOC體系中的胸腺T細(xì)胞表型影響的FCM分析結(jié)果Fig.1 Effect on the phenotype of thymic T cells from FTOC treated with IL-7

2.3 IL-7能促進(jìn)胸腺樹突狀細(xì)胞的生成和分化發(fā)育 為了避免成熟的胸腺T細(xì)胞可能對IL-7組DC分化發(fā)育產(chǎn)生影響,我們選取SCID鼠作為我們的實驗對象。經(jīng)FTOC培養(yǎng)12天后,較之于對照組,IL-7組胸腺細(xì)胞總數(shù)增加了3倍,且加入IL-7可增加DC的比例,與對照組相比較,DC數(shù)量增加了7倍(表2)。流式細(xì)胞儀分析上述胸腺細(xì)胞表型,對照組的CD11c表達(dá)百分?jǐn)?shù)為23.3%,IL-7組的CD11c上調(diào)為36.9%。此外,CD8-CD11c+和CD8-Ia+細(xì)胞的比例明顯升高,分別由對照組的8.2%和29%上升到了22.8%和43.6%(圖3)。由此表明:IL-7能促進(jìn)胸腺樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育。

通過對IL-7組和對照組的胸腺細(xì)胞形態(tài)分析顯示,IL-7組的胸腺細(xì)胞中可見有些帶有樹突狀突起的形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞,而對照組的胸腺細(xì)胞中大部分為圓形的胸腺T細(xì)胞(圖4)。

2.4 IL-7誘導(dǎo)的DC具有激發(fā) T細(xì)胞作用 在SCID鼠FTOC體系中,IL-7能誘導(dǎo)胸腺樹突狀細(xì)胞的生成。為了證明IL-7組是否能產(chǎn)生功能性樹突狀細(xì)胞,我們用純化的T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞,與IL-7組培養(yǎng)12天的胸腺細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。如圖5所示,這群細(xì)胞具有刺激異源T細(xì)胞增殖的能力。由此提示:來自IL-7組的胸腺細(xì)胞中的部分細(xì)胞不僅具有類似樹突狀細(xì)胞的形態(tài)和表達(dá)樹突狀細(xì)胞表面特異分子,而且也具有激發(fā)T細(xì)胞的作用。

表1 FTOC體系中IL-7對胸腺T細(xì)胞的影響Tab.1 Effect of IL-7 on thymic T-lymphocytes from mouse FTOC

圖2 IL-7對FTOC體系中的胸腺內(nèi)其他細(xì)胞表型影響的FCM分析結(jié)果Fig.2 Effect on phenotype of other thymic immunocytes recovered from FTOC treated with IL-7

表2 SCID小鼠FTOC體系中IL-7對胸腺細(xì)胞的影響Tab.2 Effect of IL-7 on thymocytes from SCID mouse FTOC

圖3 IL-7對SCID小鼠FTOC培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞表型影響的FCM分析結(jié)果Fig.3 Phenotypic analysis of thymocytes raised from SCID mouse FTOC

圖4 SCID小鼠FTOC培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析Fig.4 Morphology of thymocytes from SCID mouse FTOC

圖5 SCID小鼠FTOC培養(yǎng)的胸腺細(xì)胞對異源T細(xì)胞刺激增殖能力的檢測結(jié)果Fig.5 MLR-stimulatory capacity of thymocytes generated in SCID mouse FTOC

3 討論

曾有研究報道,IL-7不僅可以介導(dǎo)B細(xì)胞的生成、分化及成熟,而且對T細(xì)胞的分化發(fā)育有著重要的影響,并且IL-7與胸腺的成熟、老化之間有著重要的聯(lián)系[11,12]。IL-7是T細(xì)胞分化發(fā)育以及外周T細(xì)胞歸巢中至關(guān)重要的細(xì)胞因子[13,14]。Li等[15]發(fā)現(xiàn),前體T細(xì)胞核成熟T細(xì)胞的存活均需IL-7的參與。IL-7維持T細(xì)胞的存活主要是通過誘導(dǎo)凋亡蛋白Bcl-2的產(chǎn)生以及抑制凋亡前體蛋白Bax、Bad的作用。Van小組[16]研究發(fā)現(xiàn),IL-7在人T細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用,且是T細(xì)胞歸巢中的重要一員。Vogt等[17]實驗證明IL-7在樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。Varas等[10]在大鼠的FTOC體系中加入IL-7,抑制胸腺細(xì)胞總數(shù)的增殖,卻能夠促進(jìn)前體細(xì)胞向CD8陽性胸腺細(xì)胞分化發(fā)育,同時可以有效地促進(jìn)胸腺樹突狀細(xì)胞的生成。但有關(guān)小鼠FTOC體系中IL-7對胸腺前體細(xì)胞向各個群體細(xì)胞分化發(fā)育的影響的研究,尚無相關(guān)報道。

本研究借助小鼠的FTOC體系,發(fā)現(xiàn)IL-7在胸腺細(xì)胞的分化發(fā)育過程中發(fā)揮作用,較之于Control組,IL-7組 CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞明顯減少,而CD4-CD8-雙陰細(xì)胞顯著增加,此外在一定程度上誘導(dǎo)胸腺樹突狀細(xì)胞及胸腺內(nèi)其他免疫細(xì)胞的生成。

為了避免成熟的胸腺細(xì)胞可能對IL-7組DC分化發(fā)育的影響,我們選取SCID鼠的作為我們的實驗對象。在SCID鼠的胸腺器官培養(yǎng)體系中加入IL-7,會使樹突狀細(xì)胞的數(shù)量大量增加,這說明IL-7誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的成熟并不依賴于成熟胸腺細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子。且IL-7受體在樹突狀細(xì)胞上的表達(dá)已經(jīng)被證實[18]。其他因子,如IL-1和TNF-α已經(jīng)被證實在體外胸腺內(nèi)前祖細(xì)胞分化發(fā)育成樹突狀細(xì)胞發(fā)揮重要作用[19]。但是,胸腺樹突狀細(xì)胞的最高比例最早在基因?qū)W發(fā)現(xiàn)的,IL-7高表達(dá),而TNF-α或IL-1在胸腺中沒有檢測到有表達(dá)。由此進(jìn)一步提示IL-7在胸腺DC分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

在體外培養(yǎng)髓系的樹突狀細(xì)胞[20,21],一般來源于外周血或骨髓的CD34+造血前祖細(xì)胞或血單核細(xì)胞,主要由G M-CSF誘導(dǎo),通常也可與其他因子如TNF-α、IL-4、SCF聯(lián)合使用[19,20]。與此相反,淋系的樹突狀細(xì)胞來自早期的胸腺內(nèi)前祖細(xì)胞亞群CD44+CD25-和CD44+CD25+,無需 G M-CSF的誘導(dǎo)。另外,也有研究表明,通過選用過表達(dá)G M-CSF的轉(zhuǎn)基因鼠,或體外施加G M-CSF或G M-CSF和IL-4,均不會使脾臟和胸腺中的樹突狀細(xì)胞的數(shù)目發(fā)生明顯的變化。同樣的,缺失G M-CSF受體的小鼠以及G M-CSF敲除小鼠中樹突狀細(xì)胞的數(shù)目也沒有減少[22]。這些結(jié)果表明G M-CSF并不是已知樹突狀細(xì)胞亞群分化發(fā)育的一個主要的生長因子,由此推知,其他細(xì)胞因子將在此過程中發(fā)揮作用。近年不斷有相關(guān)的文獻(xiàn)報道,如細(xì)胞因子Flt3L能誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)的生成,G-CSF誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞的生成,TNF-α誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的生成[23-25]。

我們的初步結(jié)果顯示:IL-7可影響胸腺T細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的分化發(fā)育,IL-7是一系列影響胸腺樹突狀細(xì)胞分化的生長因子中的一種細(xì)胞因子,為研究胸腺樹突狀細(xì)胞及其亞群的功能開拓新的思路。

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[收稿2009-03-20 修回2009-12-01]

(編輯 張曉舟)

Interleukin-7 influences the development of thymic T lymphocytes and thymic dendritic cells

XU Yun-Yun,WANG Yong,LI Yi-Ping,LI Fang,XU Xiao-Xia,ZHU Shou-Bing,ZHANG Xue-Guang.Medical Biotechnology Institute of Soochow University,Suzhou215007,China

Objective:T o investigate the effect of IL-7 on differentiation of thymic Tlymphocytes and dendritic cells’differentiation in vitro.Methods:Thymic lobes were apspectically removed from 15-day-old or 16-day-old mouse fetueses and were cultured by the way of fetal thymus organ cultures(FTOC)in vitro.Lobes were cultured in the dishes with or without Interleukin-7(IL-7),then collected the cultured cells respectively.The expressionof CD4,CD8,CD11c,B220,Ia,and CD11b was detected byflow cytometry,and the morphologywasobserved under the ligt microscope.The proliferation of these cells was determined by cell counting.The cultured cells were used as stimulatorsfor allogeneic T cells,whose proliferation were detected later by MTT method.Results:The result of cell counting indicated that the total amount of the thymocytes was decresed obviously after being cultured with IL-7,while the proportion of CD4+CD8+thymocytes decreased,the proportion of CD4-CD8-,and CD4-CD8+thymocytes increased,and no much difference in the amount of CD4+CD8-thymocytes was found.In addition,the amount of B lymphocytes,natural killer cells,and dendritic cells increased in different degree.Conclusion:IL-7 participates in differentiation and development of thymic T lymphocytes and dendritic cells.

Fetal thymus organ cultures;Interleukin-7;Thymic T lymphocytes;Thymic dendritic cells

R392.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)02-0108-05

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項目(30400395)和國家教育部留學(xué)回國人員科研基金資助項目(K5120506)

許云云(1984年-),女,在讀碩士,主要從事細(xì)胞免疫的研究;

及指導(dǎo)教師:王 泳(1971年-),女,碩士生導(dǎo)師,主要從事小鼠樹突狀細(xì)胞和干細(xì)胞的研究,E-mail: yongwangnet@126.com。