陳海榮，劉前剛，高書鋒，魏小武，程 安，黃 軍

（湖南省微生物研究所，湖南長沙410009）

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物農(nóng)藥以其高效、低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢，漸漸取代了傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的地位。原生質(zhì)體融合技術(shù)，是指將一個細胞的遺傳物質(zhì)包括細胞核DNA和核外基因進入另一個細胞，有機的結(jié)合形成一個新的整體——融合子。如果融合子能穩(wěn)定的存活下來，并具備雙親的特有性質(zhì)，那么人們便能根據(jù)所需的特性，構(gòu)建自己所需的工程菌株。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一種革蘭氏陽性枝狀細菌。它最早是由日本人石渡于1901年從家蠶病尸蟲體中分離出來，并在1915年由德國人Berliner命名的。其主要殺蟲活性成分是內(nèi)部一種或多種δ-內(nèi)毒素[1]。現(xiàn)已證實蘇云金桿菌可對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等9個目的500多種昆蟲有不同程度的殺蟲活性，對水稻常見害蟲如二化螟、三化螟及縱卷葉螟均有殺治效果[2-4]?？莶菅挎邨U菌SD是一類具有抗病性的細菌，能有效防治水稻稻曲病和紋枯病，為湖南省微生物研究所植保室篩選所得。筆者擬利用原生質(zhì)體融合技術(shù)選育一株對水稻稻曲病和紋枯病有抑制效果，且能起到殺蟲作用的工程菌株用于水稻的生物防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 供試菌株為蘇云金芽孢桿菌Bt，枯草芽孢桿菌SD。

1.1.2 培養(yǎng)基 搖瓶培養(yǎng)基:蛋白胨2%，牛肉膏0.7%，葡萄糖0.3%，MgSO40.03%，KH2PO40.03%，pH 7.2～7.5，蒸餾水配置，121℃，0.8 kg/cm2蒸汽壓力滅菌30 min。

固體培養(yǎng)基（平皿，斜面用）:配方同上搖瓶培養(yǎng)基，另加1.6%的瓊脂粉，pH 7.2。

高滲固體培養(yǎng)基（原生質(zhì)體再生，融合子再生用）:上述固體培養(yǎng)基加入0.5 mol/L的蔗糖，pH 7.2（底層）。

高滲固體培養(yǎng)基（上層）:同高滲固體培養(yǎng)基，瓊脂含量為0.8%。

1.1.3 主要試劑與溶液 高滲緩沖液:順丁烯二酸0.02 mol/L，MgCl20.02 mol/L，蔗糖 0.5 mol/L，pH 7.4左右，121℃，0.8 kg/cm2蒸汽壓力滅菌30 min。

酶:溶菌酶，購自上海某生物公司，一定濃度的高滲緩沖液配制，先配成2 mg/mL的母液，使用時按需要的濃度用高滲液稀釋，細菌過濾器過濾。

1.2 方法

（1）菌株篩選：從沙土管中取出保存的Bt菌株與SD菌株，分別轉(zhuǎn)接入加有一定濃度的慶大霉素（Bt）和利福平（SD）的斜面培養(yǎng)基中，篩選出兩種具有不同抗藥性的菌株，培養(yǎng)待用。

（2）菌株活化：從斜面上挑取少量Bt和SD菌種，接種至搖瓶培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min條件下培養(yǎng)14 h左右，進行活化。

（3）菌株培養(yǎng)：分別將活化14 h的兩菌株發(fā)酵液1 mL移至 100 mL搖瓶培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)一定時間。

（4）洗滌：取兩種年輕菌液各4 mL到5 mL離心管中，離心3～5 min，除去上清，加入2 mL高滲緩沖液，振蕩均勻，再離心，重復(fù)3次，洗去細胞表面的附著物，便于酶解。

（5）酶解去壁:加入一定量的酶，在一定溫度的水浴鍋中酶解破壁，得到原生質(zhì)體。

（6）原生質(zhì)體融合:將得到的Bt與SD原生質(zhì)體等體積混合，8 000 r/min離心3 min，加入40%PEG 2 mL 和 Ca（NO3）2飽和液 0.2 mL，混勻，放入41℃水浴中融合30 min。

（7）原生質(zhì)體再生培養(yǎng):融化低層高滲固體培養(yǎng)基，冷卻至45℃時，加入慶大霉素和利福平，濃度均為1μg/mL，搖勻，倒平皿，作為底層培養(yǎng)基，每平皿20～25 mL。融化上層高滲培養(yǎng)基，冷卻至45℃時按1∶5的比例將融合的原生質(zhì)體懸濁液與其混勻，倒入底層培養(yǎng)基中，每皿5 mL左右，凝固后，放入恒溫箱30℃培養(yǎng)。

（8）待平皿中有菌落生成時，初步認定為融合子。

（9）傳代培養(yǎng):用相同濃度的慶大霉素和利福平制作雙抗試管斜面若干，將平皿中的菌落挑取少量接入其中，傳接10代，確保其菌體穩(wěn)定。

（10）菌株鑒定：取出10代菌體，進行與雙親菌株性質(zhì)的比較和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的測定及培養(yǎng)時間的選擇

分別將活化14 h的兩菌株發(fā)酵液1 mL移至100 mL空白搖瓶培養(yǎng)基中，搖勻，取15支無菌大試管，每支加入 5 mL，30℃，220 r/min 培養(yǎng)，每 1 h 取樣一次，測定560 nm下的吸光度[5]。作圖1，算出對數(shù)生長期，以便保證酶對細胞壁的作用效果最好。

在菌齡的選擇上，多采用對數(shù)生長期或生長后期的菌，這是因為菌體的不同生理狀態(tài)直接影響到細胞壁的結(jié)構(gòu)，對數(shù)生長期細菌的細胞壁中肽聚糖含量最低，細胞壁對酶的作用最敏感。由圖1可知，培養(yǎng)5 h左右后，Bt與SD都進入對數(shù)生長期。為確定被酶解破壁的細胞為對數(shù)生長期細胞，我們把活化的菌體在搖瓶中培養(yǎng)的時間確定為5 h。

2.2 酶解濃度的選擇

在 Bt和 SD菌液中分別加入 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL濃度的溶菌酶，酶解2 h，平板計數(shù)法觀察原生質(zhì)體的得率[6]，確定最佳酶解濃度。以酶濃度為橫坐標(biāo)，原生質(zhì)體得率為縱坐標(biāo)作圖2。

圖2 不同溶菌酶濃度對Bt和SD原生質(zhì)體得率的影響

酶濃度過低，會影響原生質(zhì)體得率，過高，則對后期試驗有影響。由上圖可知，兩菌株的酶解破壁都很徹底，得率在80%以上。其中SD對酶更為敏感，得率也更高?？梢猿醪酱_定，Bt的最佳酶解濃度為0.8 mg/mL，SD的最佳酶解濃度為0.6 mg/mL。

2.3 酶解時間的選擇

選擇好酶解濃度后，我們用最佳濃度對Bt和SD兩菌液進行酶解，每10 min取樣一次，平板計數(shù)法計算兩菌株原生質(zhì)體得率，用酶解時間為橫坐標(biāo)，原生質(zhì)體得率為縱坐標(biāo)作圖3。

有研究表明[7-8]，不同微生物在原生質(zhì)體制備過程中最適酶解時間差異很大。酶解時間不夠，得到的原生質(zhì)體數(shù)量過少，融合效果不好；酶解時間過長，原生質(zhì)體得率提高，但破壁過于徹底對原生質(zhì)體再生會產(chǎn)生不利影響。由圖3可知，Bt在酶解70 min后，原生質(zhì)體得率基本穩(wěn)定，SD在酶解50 min后，原生質(zhì)體得率基本穩(wěn)定?？梢曰敬_定，Bt的最佳酶解時間為70 min，SD的最佳酶解時間為40 min。

2.4 融合子的初步檢測

將兩原生質(zhì)體等量加入到高滲緩沖液中融合后，在特定的雙抗培養(yǎng)基中有菌斑出現(xiàn)。挑選菌株在雙抗培養(yǎng)基中傳接10代，確保其穩(wěn)定性。隨機挑選4個10代菌體接入含水稻稻曲病和紋枯病病原菌的培養(yǎng)皿中，作CK空白對照，觀察結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在接種菌株后的培養(yǎng)皿中，菌斑周圍有明顯的透明環(huán)，說明該菌落對水稻稻曲病和紋枯病病原菌有抑制作用，具備親本SD的抗菌效果。

選新鮮水稻葉片在一定濃度的融合子溶液中浸漬3 s，取出自然晾干，放入10個培養(yǎng)皿中。其中5個培養(yǎng)皿的葉片上接入10頭水稻二化螟2齡幼蟲，另外5個培養(yǎng)皿的葉片上接入10頭水稻縱卷葉螟2齡幼蟲，密封。48 h后觀察幼蟲死亡情況，發(fā)現(xiàn)近半害蟲已經(jīng)死亡。這說明該融合子有殺蟲功效，具備Bt的性質(zhì)。

3 小結(jié)

利用細胞融合技術(shù)構(gòu)建新型多功能工程菌，為生物農(nóng)藥的研制和開發(fā)提供了新的方法和思路。本試驗選取了兩種不同功能的微生物菌種Bt與SD，通過融合實驗條件的摸索，初步確定了菌種培養(yǎng)時間、酶解最佳濃度、酶解最佳時間，對融合子進行了部分的驗證，基本符合預(yù)想的功效。準(zhǔn)備結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性及基因檢測技術(shù)，對融合子進行進一步檢查和證實。我們希望能篩選得到一株既能殺蟲有能防治病害的融合子，為下一步開發(fā)微生物生防制劑打下堅實基礎(chǔ)。

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