朱聰英,應(yīng)永飛,韋敏玨,陳慧華,陸春波,周文海,林仙軍,羅成江

(浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,浙江杭州 310020)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中黃曲霉毒素的研究

朱聰英,應(yīng)永飛,韋敏玨,陳慧華,陸春波,周文海,林仙軍,羅成江

(浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心,浙江杭州 310020)

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中6種黃曲霉毒素(包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2)的方法。試樣中的黃曲霉毒素經(jīng)84%乙腈溶液超聲提取后,用正己烷脫脂,過霉菌毒素多功能固相萃取柱凈化,氮氣吹至干,用流動相溶解后進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。方法的最低檢出限為0.2μg·kg-1,定量限均為0.5μg·kg-1;標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5～100μg·L-1的范圍內(nèi)線性良好;加標(biāo)濃度在1.0～100μg·kg-1范圍內(nèi),飼料中黃曲霉毒素的回收率在66.1%～108%之間,批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤17.8%,能滿足相關(guān)法規(guī)要求。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS);黃曲霉毒素;飼料

Key words:high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLCMS/MS);Aflatoxins;feeds

霉菌毒素(mycotoxins),又稱真菌毒素,是某些霉菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的二次代謝有毒產(chǎn)物。在所有霉菌毒素中,黃曲霉毒素的毒性、致癌性、污染頻率均居首位,是已知毒性最強的天然物質(zhì),如黃曲霉毒素B1敏感動物(鴨雛經(jīng)口)的LD50=0.294 mg·kg-1,比氰化鉀的毒性高10倍。黃曲霉毒素對飼料質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響,主要表現(xiàn)為致癌性、遺傳毒性、致畸性,類激素中毒和白細(xì)胞缺乏癥等,還會引起腎中毒、肝中毒、生殖異常以及抑制免疫反應(yīng),給畜牧業(yè)發(fā)展和畜產(chǎn)品安全造成極大危害,因此,我國明確規(guī)定了各種飼料中黃曲霉毒素B1的允許限量值[1]。

然而,要消除霉菌毒素造成的困擾卻不容易,其中一個非常重要的原因是這些毒素的濃度通常很低,難以用常規(guī)方法測出。黃曲霉毒素包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等多種形式。但是,目前有關(guān)這些毒素的檢測方法很少,且以酶聯(lián)免疫(ELISA)法和薄層色譜(TLC)法等篩選方法檢測黃曲霉毒素B1為主[2-3],這些方法雖然在一定程度上解決了黃曲霉毒素的檢測方法問題,但由于無法對樣品進行準(zhǔn)確的定性和定量分析,且容易出現(xiàn)假陽性等問題,不能作為最終的確證方法。

黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)式示于圖1。目前該類物質(zhì)的檢測方法主要包括免疫分析法[2],薄層色譜法[3]和液相色譜法[4-5]。其中免疫法往往作為篩選方法,不能作為定性依據(jù);液相色譜法容易受到雜質(zhì)干擾,且檢測限很難達到要求;氣相色譜-質(zhì)譜法[6]作為定性方法,往往需要衍生化等步驟,操作較為繁瑣;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)是一種集高效分離和多組分定性、定量于一體的系統(tǒng),已成為近年來研究黃曲霉毒素檢測的主要方向,并已經(jīng)應(yīng)用到黃曲霉毒素的污染檢測中[6-9]。本工作采用 HPLCMS/MS法測定飲料中的黃曲霉毒素,對樣品前處理方法、液相色譜條件、質(zhì)譜條件等進行系統(tǒng)優(yōu)化,并對離子抑制效應(yīng)問題進行初步研究。

圖1 黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of the Aflatoxins

1 實驗部分

1.1 主要儀器

Waters Alliance 2695液相色譜儀-Micromass Quattro micro三重四極桿質(zhì)譜儀,配有MassLynx V4.0軟件;Sigma 3k18冷凍離心機; MS2minishaker漩渦混勻器;METTL ER XS-204電子天平;氮吹儀;Waters固相萃取裝置等。

1.2 主要材料與試劑

黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自 Fermentek公司,其中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品含量≥99.0%,黃曲霉毒素M1,M2為10 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,裝量為1.0 mL。乙腈:色譜純,購自美國Merck公司;實驗用水為milli-Q超純水;其他試劑均為分析純;TC-M160多功能凈化柱:購自美國 Trilogy公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別精密稱取5.0 mg黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2對照品,置于100 mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,即為 50 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液,置于-18℃冰箱中保存。分別吸取0.20 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液和黃曲霉毒素M1、M2標(biāo)準(zhǔn)溶液各1支,置于同一10 mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,即為1.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液,冷藏保存。

1.3.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 吸取一定量的上述混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液,添加空白樣品洗脫液,氮氣吹干后,用V(0.1%甲酸溶液)∶V(乙腈)= 1∶1的溶液稀釋成濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0、100μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱:Waters Atlantis dC18柱(3.0 mm×150 mm×3.0μm);柱溫33℃;流動相:乙腈(A)和0.1%甲酸溶液(B);流速0.3 mL·min-1;進樣量20μL。流動相洗脫梯度:0 min A 30%(φ),4.0 min A 45%(φ), 14.00 min A 100%(φ),15.00 min A 100% (φ),15.01 min A 30%(φ)。

1.4.2 質(zhì)譜條件 ESI正離子電離源;毛細(xì)管電壓3.0 kV;萃取電壓2 V;離子源溫度120℃;脫溶劑溫度為380℃;脫溶劑氣和錐孔氣均為N2,其中脫溶劑氣流速550 L·h-1,錐孔氣流速50 L·h-1;碰撞氣為高純氬氣,碰撞室的壓力0.3 Pa。采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,母離子(Q1)/子離子(Q3)對均設(shè)為單位分辨,各離子對的駐留時間(dwell time)均為0.1 s,選擇離子監(jiān)測條件列于表1。

表1 MRM監(jiān)測模式下黃曲霉毒素的監(jiān)測條件Table 1 The optimized MRM conditions for Aflatoxins

1.5 樣品處理

1.5.1 試樣提取 稱取(5±0.02)g試樣于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加入25 mL 84%乙腈溶液進行提取,渦旋混勻2 min,置于超聲波清洗器中超聲提取20 min,中間振蕩2～3次;取出,于8 000 r·min-1離心10 min,傾出上清液至分液漏斗中,加15 mL正己烷脫脂1次,待靜止分層后,取下層溶液備用。

1.5.2 試樣凈化 取 TC-M160多功能凈化柱,置于固相萃取裝置上,準(zhǔn)確量取5.00 mL下層溶液,控制流速2 mL·min-1左右,抽干,收集流出液,在 60 ℃下氮氣吹干。用 1.0 mLV(0.1%甲酸溶液)∶V(乙腈)=1∶1的溶液溶解殘渣,渦旋30 s,經(jīng)0.22μm濾膜過濾后,上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜定性定量分析

黃曲霉毒素屬于脂溶性化合物,弱極性,以V(乙腈)∶V(水)=50∶50的溶液為基準(zhǔn)流動相,采用“T”三通方式,對6種黃曲霉毒素的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化,在正離子模式下進行全掃描,以選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式。黃曲霉毒素的準(zhǔn)分子離子為正電離模式下獲得的[M+H]+,結(jié)合基質(zhì)空白和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子掃描圖,優(yōu)化錐孔電壓、錐孔氣、碰撞能量等儀器參數(shù),將各監(jiān)測離子的強度調(diào)諧至最大,從而相應(yīng)地確定了各待測物在多反應(yīng)監(jiān)測模式下信號采集的特征離子對。霉菌毒素的子離子掃描圖示于圖2。

2.2 液相色譜條件

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是溶液狀態(tài)電離,因此流動相的組成和配比不但影響目標(biāo)化合物的色譜行為,還會影響到目標(biāo)化合物的離子化效率,從而影響靈敏度。實驗選擇Waters Atlantis dC18柱(3.0 mm×150 mm×3.0μm)和Waters symmetry C18柱(2.1 mm×150 mm×3.5μm)為分離柱,在正離子模式下,流動相中加入0.1%甲酸溶液,有利于化合物的離子化。比較了2種色譜柱的分離效果,發(fā)現(xiàn)都能將被測藥物與雜質(zhì)較好的分離開,而 Waters Atlantis dC18柱比Waters symmetry C18柱效果更佳,因此選用前者作為分離柱。經(jīng)過優(yōu)化,確定了流動相比例和梯度條件,優(yōu)化后的色譜條件見1.4.1。在此條件下,各組分的色譜行為良好,減少了樣品的分析時間,達到了快速檢測的目的。在該流動相條件下,被測物容易得到 H+而離子化,在很大程度上提高了檢測的靈敏度。從加標(biāo)樣品的MRM色譜圖(圖3)可見,在待測物出峰的位置沒有雜質(zhì)干擾。

2.3 樣品前處理條件

目前,霉菌毒素的提取方法主要以甲醇、乙腈以及它們與水配制成一定濃度的混合溶液作為提取劑。本實驗在參考相關(guān)文獻[7]的基礎(chǔ)上,選擇乙腈/水溶液作為提取液,比較了80%、84%、86%、90%乙腈/水溶液的提取效率,并對提取方法、提取時間等條件進行了研究。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn),采用84%乙腈/水溶液作提取液對各個霉菌毒素的總體提取效果最佳。

固相萃取凈化方法是復(fù)雜基質(zhì)中痕量檢測進行凈化時經(jīng)常采用的方法,對不同凈化柱的凈化效果進行了比較。先后比較了Romer Multi-Sep 226型清洗柱/5mL、Romer MycoSep 226型清洗柱/5 mL和 Trilogy TC-M160多功能凈化柱,根據(jù)各自的性能和廠家提供的方法優(yōu)化了SPE凈化條件。通過比較,3種多功能凈化柱均能達到較好的凈化效果,TC-M160更加穩(wěn)定,因此,選擇TC-M160作為飼料中黃曲霉毒素的凈化柱。

2.4 線性方程和檢測限

取1.3.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的系列溶液,按1.4建立的儀器條件進行測定。采用空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法,按1.5.1樣品處理方法進行處理和檢測,以 3倍信噪比為定量限(LOD),以10倍信噪比為檢測限(LOQ),得到本方法霉菌毒素的LOD和LOQ。分別以選定的定量離子峰面積y對含量x(μg·L-1)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得線性方程和線性相關(guān)系數(shù)列于表2。

2.5 離子抑制的影響

為了考察基質(zhì)離子抑制對定量結(jié)果的影響,在1.0、5.0和50μg·kg-1的添加水平下,采用空白樣品洗脫液加標(biāo)和純標(biāo)準(zhǔn)溶液進行比較,結(jié)果表明在進行痕量分析時,樣品基質(zhì)對待測藥物的離子化影響較大,離子化效率在40%～79%之間。采用空白樣品洗脫液添加標(biāo)準(zhǔn)品作為對照溶液,可以有效降低離子抑制對檢測結(jié)果的影響,從而有效提高定量的準(zhǔn)確性。

2.6 加標(biāo)回收率和精密度試驗

取豆粕、魚粉、豬濃縮料、花生粕、雞預(yù)混合飼料、雞配合飼料作為代表性樣品,添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,使黃曲霉毒素的加標(biāo)濃度在1.0～100μg·kg-1之間,按1.5的方法處理后,進行儀器分析。每個濃度點取5份樣品,求其平均回收率,并計算批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖2 霉菌毒素子離子掃描圖Fig.2 Daughter ion scans of analytes

表2 黃曲霉毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限、定量限(n=6)Table 2 The calibration curves,corelation coefficient and LOD,LOQof Aflatoxins

實驗結(jié)果表明,本方法建立的檢測方法中,6種黃曲霉毒素的回收率在66.1%～108%之間,批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤17.8%。表3、4分別列出了豆粕、雞配合飼料中霉菌毒素加標(biāo)濃度為5.0～100μg·kg-1時的回收率結(jié)果。

圖3 多反應(yīng)監(jiān)測模式下空白加標(biāo)樣品的離子色譜圖(濃度20.0μg·L-1)Fig.3 Chromatograms of Aflatoxins by MRM mode in spiked samples(20.0μg·L-1)

表3 豆粕中霉菌毒素的添加回收率試驗(n=5)Table 3 Result of recovery experiment in soybean meal(n=5)

表4 雞配合飼料中霉菌毒素的添加回收率試驗(n=5)Table 4 Result of recovery experiment in formula feed(n=5)

2.7 樣品分析

應(yīng)用建立的分析方法,對60份隨機采集到的大豆粕、玉米蛋白飼料、魚粉、玉米酒糟蛋白飼料(DDGS)和仔雞配合飼料等樣品進行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些樣品中普遍存在黃曲霉毒素污染,尤其以黃曲霉毒素B1的污染最為嚴(yán)重,檢出率達到68.4%,濃度范圍為2.5～45.2μg·kg-1,部分飼料的檢測結(jié)果列于表5。該檢測結(jié)果表明,本方法能滿足我國對飼料中黃曲霉毒素污染進行監(jiān)控的需要。

表5 部分實際樣品中黃曲霉毒素的檢測結(jié)果Table 5 Result of testing experiments in different feeds

3 結(jié) 論

本方法建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中6種黃曲霉毒素的方法,有效縮短了檢測時間,擴展了檢測毒素種類,節(jié)約了檢測成本。在本實驗的儀器條件下,被測樣品中的各組分與樣品基質(zhì)均實現(xiàn)了較好分離,出峰時間合適,檢測靈敏度較高。實驗表明,該方法條件易于控制,結(jié)果準(zhǔn)確、加標(biāo)回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好,適用于飼料中6種黃曲霉毒素的定性、定量測定。

[1]全國飲料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.GB/T 13078—2001飼料衛(wèi)生指標(biāo)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2001.

[2]全國飲料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.GB/T 8381—87飼料中黃曲霉毒素B1的測定方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,1987.

[3]李秀芳,劉興玠,胡 霞,等.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定玉米中黃曲霉毒素B1的研究[J].衛(wèi)生研究,1987,16(1):29-31.

[4]馬 良,李培武,張 文.高效液相色譜法對農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的測定研究[J].分析測試學(xué)報, 2007,26(6):774-778.

[5]PAPP E,HOTTA K,ZARAY G,et al.Liquid chromatographic determination of aflatoxins[J]. Micro-chemical J,2002,73(1/2):39-46.

[6]Z?LL ER P,MAYER-HELM B.Trace mycotoxin analysis in complex biological and food matrices by liquid chromatography-atmospheric pressure ionisation mass spectrometry[J].J Chromatography A,2006,1 136(2):123-169.

[7]VENTURA M,GOMEZ A,ANAYA I,et al.Determination of aflatoxins B1,G1,B2 and G2 in medicinal herbs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatog A,2004, 1 048:25-29.

[8]2002/657/EC Commission decision of 14 August 2002 implementing council directive 96/23/EC, concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results,12.8.2002.

[9]The commission of the European Communities. Commission regulation(EC)No 472/2002 of 12 March 2002 amending Regulation(EC)No 466/ 2001 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs L75/20.16.3.2002.

Determination of Aflatoxins in Feeds by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHU Cong-ying,YING Yong-fei,WEI Min-jue,CHEN Hui-hua,LU Chun-bo, ZHOU Wen-hai,LIN Xian-jun,LUO Cheng-jiang
(A nimal Products Quality Testing Centre of Zhejiang Province,Hangzhou310020,China)

Totally 6 Aflatoxins in feeds were determined by high performance liquid chromatography combined with electrospray ionization triple quadrupole tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)under the multiple reaction monitoring(MRM)mode,and especially focused on the optimization of extraction,clean-up,HPLC separation and MS/MS parameters of analytes.The Aflatoxins B1,B2,G1,G2,M1and M2were extracted by 84%of acetonitrile aqueous solution,purified by passing through multifunctional cartridges.The elution was evaporated by nitrogen blow and dissolved by mobile phase,and then assayed by HPLC-MS/MS.The limits of detection(LOD)are 0.2μg·kg-1,and the limits of quantitation(LOQ)are 0.5μg·kg-1.The calibration curves are linear between 0.5μg·L-1and 100μg·L-1for Aflatoxins B1,B2,G1,G2,M1and M2.Recoveries of those mycotoxins in feeds are 66.1%—108%,and inter-relative standard deviation(n=5)is less than 17.8%at spiked level of 1.0—100μg·kg-1.The method is simple,sensitive and reliable for feed safety.

O 657.63

A

1004-2997(2010)04-0240-07

2009-12-22;

2010-03-19

朱聰英(1963～),女(漢族),浙江武義人,高級畜牧師,從事飼料、畜產(chǎn)品安全檢測方法的研究。E-mail:zjxm_zcy@163.com

應(yīng)永飛(1977～),男(漢族),浙江仙居人,獸醫(yī)師,從事獸藥殘留分析的研究。E-mail:yyf1001@163.com