湯 樺,陳大舟,吳 雪,徐銳鋒,鐘石林,邵明武,王 覃

(1.中國計量科學研究院,北京 100013;2.北京市理化分析測試中心,北京 100089)

同位素稀釋高分辨質(zhì)譜法測定魚組織中6種多環(huán)芳烴

湯 樺1,陳大舟1,吳 雪1,徐銳鋒1,鐘石林1,邵明武1,王 覃2

(1.中國計量科學研究院,北京 100013;2.北京市理化分析測試中心,北京 100089)

采用氣相色譜-雙聚焦高分辨磁式質(zhì)譜聯(lián)用儀開發(fā)了同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)測定魚組織中6種多環(huán)芳烴(PAHs)。以二氯甲烷為提取溶劑,將凍干魚組織樣品加入氘代的同位素內(nèi)標后,在50℃下索氏提取18 h,采用凝膠排阻色譜(GPC)聯(lián)用,固相萃取(SPE)進行凈化,通過條件優(yōu)化,采用二氯甲烷作為 GPC的流動相,在3.5 mL·min-1流速下,收集14～34 min的流出液,濃縮后用氟羅里硅土SPE小柱凈化,V(環(huán)己烷)∶V(二氯甲烷)=1∶1的溶液洗脫,以高分辨多離子方法(HRMS-MID)檢測,單點校正法定量。6種PAHs在3個添加水平的檢測回收率為95%～105%,精密度(RSD)為1.7%～6.0%,最小檢出限為0.8～1.6μg·kg-1。

同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS);多環(huán)芳烴(PAHs);魚組織;凝膠排阻色譜(GPC);固相萃取(SPE)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指由2個或2個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的化合物(如萘、蒽等),是一類惰性較強的碳氫化合物[1],正是由于這種較強的惰性使它們較穩(wěn)定的廣泛地分布于環(huán)境中。PAHs具有致癌、致畸及致突變性[2],致癌性隨著苯環(huán)數(shù)的增加而增加。當 PAHs與—NO、—OH、—NH2等發(fā)生作用時,會生成致癌性更強的 PAHs衍生物。目前,大多數(shù)國家都將PAHs列為環(huán)境監(jiān)測的重要內(nèi)容之一。但由于PAHs在環(huán)境中存在的濃度很低(痕量、超痕量級),環(huán)境樣品基體復雜,干擾物多,難以直接測定。海洋是地球水域的集中地,也是地球環(huán)境的主要組成部分,PAHs由海洋植物細胞吸收,進入海洋生物食物鏈,并從低營養(yǎng)級生物轉(zhuǎn)移到高營養(yǎng)級生物,最終在海洋魚類或海洋哺乳動物等生物體內(nèi)富集[3]。魚體中富集的 PAHs反映了所在環(huán)境中 PAHs的污染情況[4],是一種重要的環(huán)境評價指導性指標[5-7]。目前,國內(nèi)采用高分辨質(zhì)譜檢測魚肉基體中PAHs鮮有報道,本研究擬采用氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用,開發(fā)魚組織中6種PAHs同位素稀釋質(zhì)譜檢測方法,并探討和優(yōu)化前處理和儀器檢測過程,為相關的檢測工作提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器裝置與試劑材料

VISIPREPTM DL固相萃取裝置:美國Supelco公司產(chǎn)品;Sartorius ME 235S分析天平(最大稱量230 g,d=0.01 mg):德國 Sartorius公司產(chǎn)品;Mettler M3型分析天平 (d= 0.001 mg):瑞士Mettler-Toledo公司產(chǎn)品;RE-51旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

Finnigan MA T 900雙聚焦扇形場質(zhì)譜儀:美國熱電公司產(chǎn)品;Finnigan Trace氣相色譜:美國熱電公司產(chǎn)品,配有AS 2000自動進樣器; DB-5石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm× 0.25μm):美國J&W公司產(chǎn)品。

二氯甲烷(色譜純):德國Merck公司產(chǎn)品;丙酮(農(nóng)殘級):美國Fluka公司產(chǎn)品;環(huán)己烷(農(nóng)殘級):美國 Tedia公司產(chǎn)品;Florisil固相萃取小柱:Supeclean,3 mL;6種 PAHs標準溶液:由中國計量科學研究院提供;同位素標記物:6種氘代-多環(huán)芳烴溶液均購于美國 Cambridge Isotope公司。

1.2 儀器條件與檢測方法

1.2.1 氣相色譜條件 載氣(高純氦氣)流速: 1.0 mL·min-1;進樣口溫度:280℃,分流進樣;分流比:20∶1;進樣量:1μL;程序升溫:初始溫度70℃,保持1 min,以35℃·min-1升溫至220℃,再以3℃·min-1升溫至280℃,保持25 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源,離子源溫度250℃,電子能量70 eV,燈絲發(fā)射電流0.55 mA,電子倍增檢測器電壓1.7 kV,分辨率2 500(10%峰高)。

1.2.3 檢測方法 在多離子檢測(MID)模式下測量,采用FC43的碎片峰作為高分辨質(zhì)譜質(zhì)量鎖定和質(zhì)量校正標準,針對6種 PAHs設定不同的檢測窗口,分別測定其離子強度,每個MID窗口檢測2個離子,包括目標物離子和相應的同位素標記物離子,具體條件列于表1。

表1 6種PAHs多離子檢測(MID)的選擇離子質(zhì)量與出峰時間Table 1 Selected mass and retention time of 6 PAHs by multi-ion detection(MID)

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 提取 稱量1 g凍干魚粉和1 g煅燒過的無水硫酸鈉,混勻后加到提取筒中,并將100～200μg·kg-16種氘代多環(huán)芳烴的混合溶液加入到混合樣品中,50℃索氏提取18 h。

1.3.2 凈化 由于魚肉基體中含有大量的脂肪、蛋白等干擾物,故將提取液在濃縮后進行凝膠排阻色譜(GPC)和固相萃取(SPE)凈化。

將提取液濃縮至約0.5 mL后,完全轉(zhuǎn)移至GPC,用二氯甲烷作為淋洗液,以 3.5 mL·min-1速度淋洗,收集14～34 min的流出液。將收集的流出液濃縮后,進行 SPE凈化。固相萃取小柱先用4 mL丙酮清洗并抽干,再用4 mL二氯甲烷活化小柱,將樣品提取液轉(zhuǎn)移到小柱上,用5 mLV(環(huán)己烷)∶V(二氯甲烷)= 1∶1的溶液洗脫。接收液用氮氣吹至濃縮后,進行GC/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 GPC凈化條件優(yōu)化

GPC是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。在本實驗中,凝膠滲透色譜主要用于除去魚組織提取液中的大部分油脂和色素等大分子,以減少有機質(zhì)對目標化合物的干擾。分別選擇V(乙酸乙酯)∶V(環(huán)己烷)=1∶1的溶液和二氯甲烷作為流動相,通過對比2種流動相在不同時間的洗脫效率對GPC凈化條件進行優(yōu)化。對濃度為500μg·g-1的6種 PA Hs混合溶液進樣0.5 mL,淋洗速度為3.5 mL·min-1,接收0～36 min的淋洗液,每隔2～3 min收集1次,濃縮后進行檢測,結(jié)果示于圖1和圖2。

圖1 以V(乙酸乙酯)∶V(環(huán)己烷)=1∶1的溶液為流動相的6種PAHs的洗脫曲線Fig.1 The eluted curve of 6 PAHs by V(acetacetate)∶V(cyclohexane)=1∶1

圖2 以二氯甲烷為流動相的6種PAH s的洗脫曲線Fig.2 The eluted curve of 6 PAH s by dichloromethane

由圖中可以看出,使用V(乙酸乙酯)∶V (環(huán)己烷)=1∶1的溶液作為流動相,6種PAHs洗脫時間相差較大,收集時間約為20 min,選擇二氯甲烷作為流動相,6種PAHs幾乎在同一段時間被洗脫,收集時間縮短到10 min,故選擇二氯甲烷作為GPC洗脫6種PAHs的流動相。

2.2 SPE條件優(yōu)化

2.2.1 洗脫液種類的選擇 根據(jù)溶液極性的不同,在氟羅里土固相萃取小柱上洗脫強度不同的原理,按溶液極性大小分別選擇V(正己烷)∶V(二氯甲烷)=1∶1,V(正己烷)∶V(丙酮)= 1∶1,V(正己烷)∶V(甲苯)=1∶1, V(環(huán)己烷)∶V(二氯甲烷)=1∶1混合溶劑作為洗脫液,使用0.5 mL濃度為500μg·g-1的6種PAHs混合溶液上樣,采用6 mL溶液進行洗脫,收集洗脫液濃縮后,添加內(nèi)標,用氣相色譜-質(zhì)譜進行測定,結(jié)果表明,采用V(環(huán)己烷)∶V(二氯甲烷)=1∶1混合溶液作為洗脫液,得到的6種PAHs回收率最高,故選擇V(環(huán)己烷)∶V(二氯甲烷)=1∶1混合溶液作為洗脫液。

2.2.2 洗脫液比例的選擇 由于不同的洗脫液比例會影響洗脫效果,故分別采用V(環(huán)己烷)∶V(二氯甲烷)為1∶9、1∶4、3∶7、1∶1、7∶3、4∶1、9∶1的混合溶劑進行洗脫,添加內(nèi)標后,進行氣相色譜-質(zhì)譜測定。以回收率為縱坐標,6種PAHs的洗脫溶劑比例為橫坐標,結(jié)果表明V(環(huán)己烷)∶V(二氯甲烷)=1∶1為較理想的洗脫液比例。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用高分辨質(zhì)譜以多離子檢測的方式測定,在MID模式下測量,采用PFK的碎片峰作為高分辨質(zhì)譜質(zhì)量鎖定和質(zhì)量校正標準,針對6種PAHs及其同位素稀釋劑設定不同的檢測窗口,分別測定其離子流強度。

2.3.1 選擇離子 多環(huán)芳烴的基峰強度最高,選擇其為檢測的特征離子。

2.3.2 分辨率 分別采用 R=1 000、R= 2 500、R=5 000、R=10 000分辨率對含有低濃度PAHs的魚肉萃取樣品進行檢測,當分辨率R=2 500時,基體干擾較小,而且信號強度較高,信噪比最好。進一步提高分辨率,可以減少干擾,但樣品信號強度下降,因此選擇 R= 2 500。

2.3.3 離子源溫度 提高離子源溫度,有利于提高多環(huán)芳烴的檢測靈敏度,綜合考慮離子源加熱絲壽命等因素,選擇離子源溫度為250℃。

2.4 定量方式的選擇

本實驗采用同位素稀釋質(zhì)譜單點校正法定量,定量公式如下:

式中:RSM為樣品溶液目標峰面積與標記物峰面積的比值;RCM為標準溶液目標峰面積與標記物峰面積的比值;Ccalib為標準溶液的濃度; Mspike(sample)為加入樣品中的標記物的質(zhì)量; Cspike(calib)為加入標準溶液中的標記物的濃度; Msample為樣品質(zhì)量;fpurity為標準品的純度;fdry為樣品干燥后與干燥前質(zhì)量的比率。

為了保證測定結(jié)果的準確性,同位素稀釋質(zhì)譜單點法測定的標準溶液濃度及添加到樣品中的同位素稀釋劑濃度應與被測樣品溶液的濃度相近。故先經(jīng)過初步測試,用單點校正法計算樣品中多環(huán)芳烴的大概濃度,得到一個初步測試值。根據(jù)初步測試值,精確配制一個與此濃度接近的混合標準溶液,并在樣品和標準溶液中根據(jù)1∶1的比例添加標記物,用本工作建立的流程進行分析,單點校正法計算樣品中多環(huán)芳烴的濃度。

2.5 回收率、精密度與檢出限

取空白凍干魚組織樣品,分別添加濃度水平相當于100、20和5μg·g-1的6種PAHs混合溶液,按上述方法重復分析,得到的精密度與回收率列于表2。降低添加濃度水平,相當于10 μg·g-1和5μg·g-1的 PAHs混合溶液,以3倍信噪比為最小檢出限,結(jié)果列于表2。

表2 魚組織樣品中6種PAHs的回收率、精密度與檢出限Table 2 The recovery,RSD and detection limit of 6 PAHs in freezing dry fish tissue sample

2.6 樣品測定

應用本實驗方法測定凍干鲅魚、梭子魚和鱈魚組織樣品中的6種PAHs,得到的結(jié)果列于表3。樣品中6種PAHs及同位素的提取離子質(zhì)譜圖示于圖3。

2.7 測量結(jié)果的不確定度分析

根據(jù)2.4中的計算公式,測量結(jié)果的不確定度主要來源于儀器測量的標準偏差、標準溶液的不確定度和樣品稱量的不確定度等,相對分子質(zhì)量、溫度、濕度等引起的測量不確定度可忽略不計。

儀器測量的不確定度包括測試過程中的隨機誤差,體現(xiàn)為測量結(jié)果的標準偏差,記為Ua;標準溶液的不確定度來源于溶液標準物質(zhì),由標準物質(zhì)證書上的標準不確定度獲得,記為Ub;樣品稱量不確定度,記為Uc,根據(jù)檢定證書和稱量次數(shù)估算,天平稱量帶來的不確定度為0.5%。合成3個不確定度分量Ua、Ub和Uc,取包含因子k=2,故擴展不確定度表示為:

每個樣品的不確定度評估結(jié)果列于表3。

表3 凍干鲅魚、梭子魚和鱈魚組織樣品中6種PAHs含量的測定結(jié)果Table 3 Results of 6 PAHs in freezing dry spanish mackerel,barracuda and cod tissue

圖3 鲅魚樣品中6種PAHs及其同位素提取離子質(zhì)譜圖Fig.3 GC-HRMS MID chromatogram of 6 PAHs in freezing dry spanish mackerel

3 結(jié) 論

采用氣相色譜-雙聚焦高分辨磁式質(zhì)譜聯(lián)用儀開發(fā)了同位素稀釋質(zhì)譜法測定魚組織中6種PAHs的檢測方法。凍干后的魚肉樣品經(jīng)過添加同位素稀釋劑、索氏抽提、凝膠滲透色譜和固相萃取凈化、濃縮等前處理步驟,采用高分辨多離子檢測方式,將目標物質(zhì)量精確到小數(shù)點后4位,從而最大可能地排除相同整數(shù)位質(zhì)量數(shù)的干擾離子,大大降低了背景噪聲,顯著提高了測量的靈敏度和選擇性。結(jié)果表明,該方法準確、可靠、靈敏度高,可對魚類樣品中痕量PAHs的確證和準確檢測提供可靠的技術支持。

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Determination of Six Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Fish Tissue by Isotope Dilution GC/HRMS

TANG Hua1,CHEN Da-zhou1,WU Xue1,XU Rui-feng1, ZHONG Shi-lin1,SHAO Ming-wu1,WANG Tan2
(1.N ational Institute of Metrology,Beijing100013,China; 2.Beijing Center f or Physical and Chemical A nalysis,Beijing100089,China)

An isotope dilution mass spectrometry(IDMS)method for the determination of 6 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs),including fluoranthene,benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene,benzo[a]pyrene,benzo[g,h,i]perylene,indeno[1,2,3-c,d]-pyrene,in freezing dried fish tissue was established.6 PAHs were extracted with dichloromethane by soxhlet extraction under 50℃for 18 h.Purification of extracts was carried out by gel permeation chromatography(GPC)and solid phase extraction(SPE).Dichloromethane was chosen as mobile phase after comparing the eluting effect of 6 PAHs with V(ethyl acetate)∶V(cyclohexane)=1∶1,and V(cyclohexane)∶V(dichloromethane)= 1∶1 was chosen as eluting solution of SPE after optimizing the type and ratio of eluting solution.6 PAHs were separated by capillary column DB-5(30 m×0.25 mm×0.25μm)withhelium as carrying gas.6 PAHs were quantified by high resolution mass spectrometry multi-ion detection(HRMS-MID),using deuterated PAHs as internal standards,single point method.The recoveries of 6 PAHs are in the range of 95%—105%.The detection limits of 6 PAHs are 0.8—1.6μg·kg-1(dry weight).The RSD(n=6)ranges from 1.7% to 6.0%.The methods was applied to three fish sample,the spectrum of the sample showed the little inference and ideal sensitivity of the method.With good sensitivity and accuracy,this method will be successfully applied to the qualitative and quantitative analysis of fish tissue sample.

isotope dilution mass spectrometry(IDMS);polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs);fish tissue;gel permeation chromatography(GPC);solid phase extraction(SPE)

O 657.6

A

1004-2997(2010)04-0208-06

2009-11-25;

2010-03-22

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局食品安全專項(SPAQ06-4)資助

湯 樺(1977～),女(漢族),山東人,工程師,從事食品安全與環(huán)境中有機污染物的質(zhì)譜分析研究。E-mail:tanghua@nim.ac.cn