吳新華,朱瑞芝,王 凱,任卓英,牟定榮,魏萬之,繆明明

(1.紅塔煙草(集團)有限責任公司技術中心,云南玉溪 653100; 2.昆明理工大學,云南昆明 650224;3.湖南大學化學化工學院,湖南長沙 410082; 4.云南煙草科學研究院,云南昆明 650106)

超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法快速分析煙草中7種潛香物質

吳新華1,2,朱瑞芝1,3,王 凱1,3,任卓英1,牟定榮1,魏萬之3,繆明明4

(1.紅塔煙草(集團)有限責任公司技術中心,云南玉溪 653100; 2.昆明理工大學,云南昆明 650224;3.湖南大學化學化工學院,湖南長沙 410082; 4.云南煙草科學研究院,云南昆明 650106)

使用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質譜(UPLC-ESI-MS/MS)在多反應離子監(jiān)測(MRM)模式下分離鑒定了煙草中7種潛香物質。煙樣經甲醇提取,XAD-2柱分離純化,選擇中性丟失162 u掃描確定母離子。通過對母離子二級質譜掃描(MS2),并根據m/z192.7、179.2、163.1、134.7、133.2等特征碎片離子峰分析結果確定了7種潛香型物質,分別為熊果苷、香豆酸-葡萄糖苷、香豆素奎尼酸、新綠原酸、綠原酸、葡萄糖基阿魏酸、3-氧化紫羅蘭醇葡萄糖苷。

煙草;潛香物質;超高效液相色譜-質譜聯(lián)用

Key words:tobacco;aroma precursors;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization(UPLC-MS/MS)

卷煙香吃味是煙草品質的重要體現(xiàn),因此對于煙草香味成分的分離、鑒定和分析一直以來都是煙草研究的重要領域。其中潛香物質是煙草香氣組成的重要部分,包括有機酸、多酚(主要以葡萄糖苷和酯的形式存在)等。這些化合物在煙葉生長發(fā)育過程中形成,其本身不具有香氣特征,但在煙草成熟、調制、醇化和燃燒過程中,可釋放出香氣物質,從而對煙氣香味產生貢獻。潛香物質在煙草調香過程中具有重要作用,對煙草等級、煙氣特征、吸食品位都有重要的影響[1]。

目前對容易獲得標樣的潛香物質的分析方法主要有液相色譜法[2-4],而對于很難獲得對照品的潛香物質,如糖苷物質,其分析方法主要有以下3種:1)先衍生化處理,再使用氣相色譜-質譜聯(lián)用的方法進行分析[5];2)先將糖苷粗提物酶(水)解,然后用氣相色譜法或氣相色譜-質譜聯(lián)用法分析糖苷酶(酸)解后的苷元,對糖苷結合態(tài)香味成分進行定性定量分析[6-8];3)分離純化,結合核磁分析和氣相色譜進行定性定量分析[9]。以上對于難以獲得標樣的糖苷類潛香物質的分析方法,均存在前處理復雜、分析周期長等缺點,本工作通過UPLC-ESI-MS/MS的中性丟失掃描,采用多反應離子監(jiān)測(MRM)模式,分離鑒定煙草中的7種潛香物質。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AcquityTM超高效液相色譜儀:美國 Waters公司產品;API 3200 QTrap串聯(lián)三重四極桿線性離子阱質譜儀:美國ABI公司產品;Millipore超純水儀:美國 Millipore公司產品;Branson 3510超聲波發(fā)生儀:Branson公司產品。

甲醇(色譜純):美國Fisher公司產品;水為去離子水;其他有機試劑均為分析純。2007年產玉溪 KC3FG 46-2-3烤煙樣品:由紅塔集團提供。

1.2 樣品處理

1.2.1 潛香物質的分離 準確稱取10 g煙樣(過80目篩)于錐形瓶中,加入100 mL甲醇超聲萃取1 h,萃取液過濾濃縮至干,加入100 mL水溶解過XAD-2柱,先用400 mL水洗去酸、堿和糖等;再用300 mLV(乙醚)∶V(正己烷)= 1∶1的溶液洗去游離香味物質和油脂、臘質成分;最后用300 mL甲醇洗脫潛香物質[9],甲醇洗脫液過0.22μm濾膜,待質譜中性丟失掃描分析用。

1.2.2 UPLC-MS/MS分析樣品 準確稱取1 g煙樣(過80目篩)于錐形瓶中,加入50 mL甲醇超聲萃取1 h,靜置,取上清液1 mL過0.22 μm有機系濾膜,進行UPLC-MS/MS分析。

1.3 色譜質譜條件

AcquityTMBEH C18色譜柱 (2.1 m × 100 mm×1.7μm);柱溫40℃,樣品室溫度4℃;進樣體積2μL;流動相A為甲醇,B為0.1%乙酸-乙酸銨(10 mmol·L-1)水溶液;流速0.4 mL·min-1;洗脫條件為:0～2 min,由10%A線性變化為100%A,并保持4 min,6～7 min,由100%A臺階梯度變化為10%A。

電噴霧負離子模式;電噴霧電壓-4 500 V;離子源溫度500℃;離子源輔助氣1,2:4.14× 105Pa。

2 結果與討論

2.1 潛香物質的鑒定

根據文獻報道[10],以吡喃葡萄糖結合的糖苷、咖啡酸等物質在ESI-MS/MS分析中易產生中性丟失162 u的峰,通過實驗發(fā)現(xiàn),鼠李糖苷除據文獻報道的丟失碎片峰146 u外,也有丟失162 u的現(xiàn)象,這可能是鼠李糖基和連接苷鍵的O一起丟失而產生的162 u丟失;香豆酸衍生物也有中性丟失162 u,這可能為丟掉香豆酸。本實驗利用質譜的中性丟失掃描功能,在優(yōu)化的碰撞能條件下,對經過前處理的煙草樣品進行中性丟失162 u的掃描,得到7種潛香型物質,質譜圖示于圖 1。帶負電荷的母離子分別為:m/z 271.1、325.3、337.1、353.3、355.4、369.0。對分子離子做MS2碎裂分析,全掃描質譜圖示于圖2。對于有雜質干擾的目標物,采用多反應監(jiān)測模式同時檢測所有子離子,根據液相梯度洗脫下各離子的保留時間確定目標物碎裂峰和雜質碎片峰,其液相色譜圖示于圖3。

圖1 煙樣中性丟失掃描質譜圖Fig.1 Neutral loss scan mass spectrum of tobacco sample

圖2 煙葉中7種潛香物質的MS2碎片離子全掃描質譜圖Fig.2 MS2product ion spectra of 7 aroma precursors in tobacco

分子離子 m/z271.3含有碎片離子 m/z 163.4和133.2,分析為葡萄糖基,苷元離子峰[M—162]-為m/z108.9,結合文獻[11]判斷為熊果苷,其碎裂為分子離子的糖基丟失—CH2OH,產生碎片離子m/z241.8,熊果苷糖基葡萄糖環(huán)斷裂—CO,產生碎片峰m/z213.0。

分子離子 m/z325.3含有碎片離子 m/z 163.1和133.3,分析為葡萄糖基,苷元離子峰[M—162]-為m/z163.1,結合文獻[11]判斷為香豆酸-葡萄糖苷。推測其碎裂規(guī)律為:分子離子的糖基丟失—CH2OH,產生碎片離子 m/z 294.9,香豆酸-葡萄糖苷糖基葡萄糖環(huán)斷裂—C2H2O,產生碎片離子 m/z252.8,m/z 118.9是香豆酸丟失—COOH產生的。

圖3 多反應監(jiān)測m/z353.3子離子液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram ofm/z353.3 with multiple reaction monitoring

分子離子m/z337.1產生碎片 m/z162.8,但無糖基進一步的裂解碎片 m/z133.1,也無糖基丟失—CH2OH產生碎片峰,排除是糖苷可能,分析 m/z118.9為162.8 u丟失—COOH,判斷為香豆酸,結合特征峰m/z191.1判斷為香豆素奎尼酸,其碎裂為分子離子先失 H2O產生碎片離子峰m/z321.3,再丟失—COOH產生碎片峰 m/z279.3,香豆酸在丟失—COOH產生m/z118.9碎片后,再丟失末端—C2H2產生碎片離子m/z93.0。

分子離子 m/z353.3的碎片離子主要有m/z134.8,163.1,173.2,176.9,179.0,191.0。通過MRM模式下的液相梯度洗脫,發(fā)現(xiàn)離子對353.3>134.8,353.3>173.2,353.3>179.0, 353.3>173.2,與文獻報道的新綠原酸和綠原酸的子離子相同[12],保留時間分別為1.33、1.54 min,碎片峰m/z163.1和176.9,其保留時間均為3.37 min,可判斷為雜質碎片。推測其碎裂規(guī)律為:母離子斷裂C—O鍵形成咖啡酸碎片離子m/z178.8和奎尼酸碎片離子 m/z190.9 ([M—178.8]-),咖啡酸進一步丟失—COOH產生碎片離子m/z134.8,[M—178.8]-脫水形成碎片離子峰m/z173.2。

分子離子 m/z355.1的碎片離子有 m/z 192.7和134.8,分析為阿魏酸,m/z163.1為阿魏酸丟失 CH3O,m/z134.8為進一步丟失—COOH產生。根據碎片m/z179.2和163.1,判斷含有糖基,結合文獻[13]分析為葡萄糖基阿魏酸。

分子離子 m/z369的碎片離子有 m/z 192.9、179.2、163.2、132.9,分析含葡萄糖基,糖基碎片離子峰m/z179丟失與苷鍵連接的O產生碎片 m/z163.2,丟失CH2O產生碎片離子m/z132.9。此外,有 m/z160.9碎片峰分析為糖基丟失—C3H6O2苷元從雙鍵處斷裂丟失—C10H14O產生的。結合文獻[8]分析為3-氧化紫羅蘭醇葡萄糖苷。

綜上,對煙葉中7種潛香物質進行了鑒定,其分析結果列于表1。

2.2 潛香物質的質譜碎裂規(guī)律研究

根據上述裂解碎片離子的結構分析,確定了不同潛香型物質特征碎片峰,并總結其在 ESIMS/MS模式下的碎裂規(guī)律,示于圖4。糖苷物質易斷裂糖苷鍵和—CH2OH,形成 m/z163, 133等特征離子峰;香豆酸和咖啡酸易丟失—COOH分別形成 m/z118.9,134.8等特征離子峰;阿魏酸易丟失—CH3O和—COOH形成m/z163.1,134.7等特征離子峰。

表1 煙葉中7種潛香物質的液相色譜-質譜分析參數及結果Table 1 The parameters and results of 7 aroma precursors by UPLC-MS/MS

圖4 潛香型物質碎裂規(guī)律Fig.4 The fragmentation of aroma precursors

3 結 論

建立了超高效液相色譜-質譜法分析煙葉中7種主要潛香型物質的方法。使用中性丟失掃描并結合MS2特征離子峰分析,能快速的確定潛香型物質母離子及其碎片離子。

在沒有標準品的情況下,由于樣品中與目標物母離子質量數相同的雜質很多,采用樣品做MS2掃描會產生很多雜質碎片峰,通過對各碎片離子的多反應監(jiān)測保留時間的對比,可以有效的排除雜質離子,便于碎裂規(guī)律分析,適合復雜體系未知物結構的研究。

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Rapid Analysis of 7 Aroma Precursors in Tobacco by UPLC-ESI-MS/MS

WU Xin-hua1,2,ZHU Rui-zhi1,3,WANG Kai1,3, REN Zhuo-ying1,MOU Ding-rong1,WEI Wan-zhi3,MIAO Ming-ming4
(1.R&D Center ofHongta Tobacco(Group)Co Ltd,Yuxi653100,China; 2.Kunming University of Science and Technology,Kunming650224,China; 3.School of Chemistry and Chemical Engineering,Hunan University,Changsha410082,China; 4.Yunnan Academy ofTobacco Science,Kunming650106,China)

A method for identification of 7 aroma precursors in tobacco was established by using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry interfaced with electro-spray ionization(UPLC-ESI-MS/MS)in the multiple reaction monitoring(MRM) mode.Aroma precursors in tobacco were extracted with methanol,cleaned up with XAD-2 column,then detected and identified by ESI-MS/MS with the neutral loss method.According to the characteristic product ions ofm/z192.7,179.2,163.1,134.7,133.2 acquired by product ion scan(MS2),7 potential flavor compounds are identified,they are arbutin, trans-p-coumaric acid-4-o-β-D-glucopyrannoside,coumaroylquinic acid,neochlorogenic acid,chlorogenic acid,feruloylglycoside,3-oxo-α-ionol-β-D-glycoside.The method is rapid, convenient and suitable for the determination of aroma precursors in tobacco leaves.

O 657.63

A

1004-2997(2010)02-0088-06

2009-08-27;

2009-11-24

吳新華(1984～),男(漢族),湖北監(jiān)利縣人,碩士研究生,從事煙草化學研究。E-mail:wuxinhuagg@yahoo.com.cn

朱瑞芝(1978～),女(漢族),湖北公安縣人,博士,從事煙草化學研究。E-mail:zhu.ruizhi@163.com